槟榔多酚提取工艺的优化

王 燕，刘书伟，张田田，侯亚楠，沈梦霞

(1.海南热带海洋学院 生态环境学院，海南 三亚 572022；2.三亚市功能槟榔研究重点实验室，海南 三亚 572022)

0 引言

槟榔(ArecacatechuL.)是棕榈科多年生常绿乔木，属温湿热型阳性植物，主要分布在南北纬28°之间。海南省槟榔产量位居世界第二位，海南省也是我国槟榔的最大产区，槟榔已成为海南仅次于橡胶的第二大热带特色经济作物[1]。槟榔作为传统中药材，位居我国四大南药之首[2]。现代药理研究表明，槟榔中含有多种活性成分和代谢产物，具有促消化[3]、抑菌[4]、降血糖[5]、驱虫[6]、抗抑郁[7]和抗氧化[8]等功能[9]。槟榔中含有的活性成分主要为生物碱、黄酮、鞣质、脂肪酸、萜类和甾体等[10]。槟榔多酚是槟榔的次级代谢产物，槟榔果中含有大约15%的酚类物质[11]。研究表明，槟榔多酚具有较强的抗氧化性，对槟榔抗氧化活性的贡献可达到82.05%[12]，此外还具有抑菌抗病毒[13]、抗抑郁[14]、降血糖[15-16]等多种生理和药理活性。

目前，槟榔多酚的多种生物活性引起相关研究人员的高度关注，但对槟榔多酚提取工艺的研究和报道较少。为了更有效地提取槟榔多酚，本文采用响应面法优化多酚提取工艺中的因素参数，响应面法可以通过回归模型方程和直观图形高效、全面地对提取工艺参数进行分析及可行性判定[17]。本研究以新鲜全槟榔烘干样为试验材料，以槟榔多酚得率为评价指标，通过单因素实验确定不同提取工艺参数(料液比、提取时间、乙醇体积分数和提取温度)的适宜数值后，采用响应面法进行实验设计、回归方程模型拟合及对因素参数进行优化，确定多酚最佳提取工艺，提高槟榔多酚得率，为槟榔多酚的提取及相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料来源及预处理：2020年11月在琼海市一处槟榔园采摘可上市的优质新鲜槟榔，洗净晾干后切成两半，放于烘箱中80 ℃杀青、60 ℃鼓风烘干，然后用粉碎机将干果粉碎,混合均匀备用。

主要试剂：没食子酸(标准品，北京索莱宝科技有限公司)，无水乙醇(AR)、福林酚试剂(BR)、碳酸钠(AR，西陇科学股份有限公司)。

1.2 主要仪器与设备

DHG-9140A电热鼓风干燥箱(博造机械设备有限公司)；HH-S4型恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)；ME204E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；UV2300分光光度计(上海元析仪器有限公司)；微型粉碎机(上海微型电机厂)；RE311型旋转蒸发仪(大和科学重庆有限公司)；LC-HL210D离心机(上海力辰仪器科技有限公司)。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 浸提槟榔多酚

按照单因素实验要求称取适量槟榔粉末放入试管中，加入相应浓度的乙醇作为提取液，放入水浴锅中，在设定的实验条件下浸没提取槟榔多酚，之后转移到转速3 500 r·min-1的离心机中离心10 min，收集上清液，于45 ℃真空旋转蒸发(转速14 r·min-1)除去乙醇，得到槟榔多酚粗提液，用蒸馏水定容至1 000 mL待测。

1.3.2 测定槟榔多酚含量

槟榔多酚采用福林酚比色法[18]测定。用没食子酸制作标准曲线，以没食子酸的浓度(μg·mL-1)为横坐标，吸光值(OD)为纵坐标，经Excel表格处理得到二元一次标准曲线方程：y=0.031 5x-0.016 8，R2=0.993 9。槟榔多酚计算参考田燕楠等[19]的如式(1)的计算方法。

(1)

其中：Y代表多酚得率(mg·g-1)；X1代表多酚浓度(mg·mL-1)；X2代表提取液定容体积(mL)；X3代表槟榔粉末质量(g)。根据标准曲线方程和多酚得率公式计算槟榔多酚得率，每个样品平行试验3次。

1.3.3单因素试验

按照1.3.1和1.3.2的多酚测定方法，在参考文献[20-21]的基础上设置单因素试验并做修改。在预实验的基础上，以槟榔多酚得率为指标，分别测定不同料液比(0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 g·mL-1)、提取时间(10、30、50、70、90 min)、乙醇体积分数(10%、25%、40%、55%、70%、85%)、提取温度(30、45、60、75、90 ℃)下多酚得率的变化情况，并确定各因素适宜取值。

1.4 数据统计

每项实验测定均设3次重复。采用Design-Expert 8.0.6.1软件进行响应面设计处理分析；采用Excel 2007进行数据整理和制图。

2 结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1料液比的影响

在乙醇体积分数40%、提取温度60 ℃、提取时间50 min的条件下，分别测定不同料液比0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 g·mL-1对槟榔多酚得率的影响。由图1可知，多酚得率随料液比的增大而增大，直至料液比为0.150 g·mL-1时达到最大值，而后降低。这可能是随着料液比增大，活性成分浓度增大，使得多酚得率增大，但料液比过大则使溶剂渗透压降低，不利于活性成分的溶出，导致多酚得率降低[22]570。然而在实际操作中，料液比达到0.125 g ·mL-1时浸提液已过于浓稠不利于操作，所以从经济、操作方便性等方面考虑，以0.100 g·mL-1为最佳提取料液比。同时料液比这一单因素不进行响应面法分析。

2.1.2提取时间的影响

固定料液比0.100 g·mL-1，在乙醇体积分数40%、提取温度60 ℃条件下，分别测定不同提取时间10、30、50、70、90 min对槟榔多酚得率的影响。由图2可知，槟榔多酚得率随提取时间增长而增大，至50 min时达到峰值，而后急剧下降。其原因可能是随提取时间增长，槟榔样品与溶剂充分接触致使多酚更加有效地从样品中释放，但提取时间过长，提取出的酚类物质可能会被空气中的氧气破坏，导致多酚得率降低[23]。因此提取时间以50 min为宜。

图1 料液比对槟榔多酚得率的影响 图2 提取时间对槟榔多酚得率的影响

2.1.3乙醇体积分数的影响

固定提取时间50 min、料液比0.100 g·mL-1，在提取温度60 ℃的条件下，分别测定不同乙醇体积分数10%、25%、40%、55%、70%、85%对槟榔多酚得率的影响。由图3可知，乙醇体积分数低于40%时，多酚得率随乙醇体积分数升高快速增加，在乙醇体积分数为55%时达到峰值，之后呈缓慢降低的趋势。这可能是乙醇体积分数升高更容易破坏槟榔样品中多酚类物质与其他物质间的氢键，从而提高多酚得率，但乙醇体积分数过高导致溶液极性降低，使槟榔样品中其他醇溶性物质与多酚产生竞争性溶出，导致多酚得率降低[24]31。因此乙醇体积分数以55%为宜。

2.1.4提取温度的影响

固定提取时间50 min、料液比0.100 g·mL-1、乙醇体积分数55%的条件下，分别测定不同提取温度30、45、60、75、90 ℃对槟榔多酚得率的影响。由图4可知，槟榔多酚得率随提取温度的增加缓慢增加至75 ℃时达到峰值，之后呈平缓下降趋势。原因可能是随着温度的逐渐升高，分子的溶出与扩散加快，从而提高多酚得率；而温度过高时，多酚类物质结构可能被破坏或与其他成分产生竞争性溶出而降低多酚得率[24]32。因此提取温度以75 ℃为宜。

图3 乙醇体积分数对槟榔多酚得率的影响 图4 提取温度对槟榔多酚得率的影响

2.2响应面法实验结果

2.2.1响应面法实验方案与结果

根据单因素实验确定的各因素数值，以提取温度(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)为自变量，以槟榔多酚得率Y为响应值，使用Design-Expert 软件中的Box-Behnken中心组合实验设计，响应面分析试验设计为3因素3水平。响应面试验因素、试验设计及结果见表1。

表1 提取温度、时间与乙醇体积分数及其水平对多酚得率影响的响应面试验设计及结果

2.2.2回归方程与方差分析

以槟榔多酚得率Y为响应值，利用Design-Expert软件对各提取工艺因素进行拟合分析，得到Y对A、B、C的回归方程模型为

Y= 19.69-0.59A+0.27B+0.25C-1.11AB-0.11AC-0.33BC-0.41A2-0.93B2+0.45C2,

(2)

对回归方程模型进行方差分析，如表2所示。

由表2可知，A、AB(交互项)、B2、C2的P值均小于0.01，说明该因素或交互因素极显著地影响槟榔多酚得率；B、C、交互项BC、A2的P值小于 0.05，说明该因素或交互因素显著地影响槟榔多酚得率；交互项AC的P值大于 0.05，说明该交互项对槟榔多酚得率没有显著影响。分别用FA、FB、FC表示因素A、B、C对槟榔多酚得率影响的参数(对应的F值)，根据F值的大小[22]572可知，这3个提取因素参数对槟榔多酚得率的影响为：FA>FB>FC。

表2 槟榔多酚得率与提取温度、时间、乙醇体积分数的回归方程模型方差分析结果

表2 (续)

2.2.3响应面曲线

用Design-Expert软件做出3个提取工艺因素之间的两两因素交互作用的响应面曲线图，结果见图5～图7。响应面曲线图可反映出提取因素之间两两交互作用是否对槟榔多酚得率具有显著影响，若响应面坡度越陡峭，表明响应值受该实验因素的影响越大变化也越大[22]573，即说明该因素对多酚得率的影响越大，反之则影响越小。

图5 乙醇体积分数和提取温度的响应面

图6 槟榔多酚得率提取时间和提取温度的响应面 图7 槟榔多酚得率提取时间和乙醇体积分数的响应面

由图5～图7可看出，3个提取因素参数对槟榔多酚得率的影响为：FA>FB>FC；交互项对多酚得率的影响中，A与B、B与C交互作用显著，A与C交互作用不显著。此结论与表3的方差分析结果相同。

2.2.4最佳提取工艺及验证实验

在料液比为0.100 g·mL-1的条件下，通过软件分析预测得出槟榔多酚的最佳提取工艺为：乙醇体积分数63.45%、提取温度60 ℃、提取时间70 min。考虑到实际操作的可行性，将乙醇体积分数修改为64%，其他2个因素的参数不变。在此最佳提取工艺参数下进行3次验证实验，槟榔多酚得率分别为20.58、19.22、21.86 mg·g-1，取平均值后得到槟榔多酚得率实际值为(20.55 ± 0.706)mg·g-1，与模型的理论预测值20.98 mg·g-1的相对误差为2.03%，说明该优化后的提取工艺准确性高、可行。普义鑫[25]以甲醇为溶剂，经响应面优化提取工艺后，槟榔多酚提取率为17.82 mg·g-1，稍低于本试验的提取率。韩林[26]以乙醇为溶剂，采用超声波辅助响应面法优化提取工艺后得到槟榔核中总酚含量为160.95 mg·g-1，高于本试验结果，原因一是可能提取方法存在差异；二是总酚含量包含多酚和单酚；三是槟榔核中多酚含量远高于槟榔壳和槟榔花[25]。

3 结论

本研究以全槟榔为原料，以槟榔多酚得率为响应值，采用单因素实验及响应面法优化槟榔多酚提取工艺。实验结果表明，该回归方程模型极显著，与实验拟合程度良好；回归方程的方差分析及两两因素交互作用响应面曲线图表明，在提取工艺因素参数对槟榔多酚得率的影响中，以提取温度的影响最显著，其次是乙醇体积分数和提取时间；在固定料液比0.100 g·mL-1的条件下，根据回归方程模型进行预测和验证性实验，确定了槟榔多酚的最佳提取工艺参数为提取温度60 ℃、乙醇体积分数64%、提取时间70 min。在此最佳工艺条件下，槟榔多酚得率为(20.55±0.706)mg·g-1，与理论预测值相对误差较小。该研究可为槟榔多酚的提取及槟榔药用资源的开发提供参考依据。