猪粪肠球菌的分离鉴定与药物敏感性分析

肖正中，凌文卿，蔡秋香，陈少珍，周文杰，邬苏晓

（韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005）

粪肠球菌也称粪链球菌，广泛存在于人和动物肠道中，在养殖生产中常作为益生菌使用［1］，同时也是一种重要的条件致病菌，能够引起人和动物多个器官的感染［2-3］.近年来关于粪肠球菌感染的报道也越来越多［4-5］.由于抗生素的广泛使用，许多粪肠球菌逐渐发展成为获得耐药性菌株，其所致感染较难控制，使得临床药物治疗的难度越来越大，一些经验性的药物治疗很难充分发挥作用［6-8］，由此造成养猪生产中病死率增加的风险也逐步提高.本实验旨在通过对猪源粪肠球菌的分离鉴定及分离株的药物敏感性分析，为猪场临床合理用药提供参考，为动物源细菌耐药性监测提供数据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品

猪直肠粪样31 份，采集于粤北某猪场.

1.1.2 药品与试剂

PSE 培养基、M-H 培养基、叠氮化钠葡萄糖肉汤培养基均购自青岛海博生物公司；PCR 相关试剂（Premix TaqTM、DNA DL2000 Maker、缓冲液等）购自TaKaRa 公司；药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司.

1.2 方法

1.2.1 样品采集

以无菌棉拭子于猪肛门处采样，接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤培养基，于37 ℃增菌培养12 h.

1.2.2 细菌分离培养

取增殖培养的菌液接种于PSE 培养基，37 ℃培养24 h，挑取黑色单菌落，接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤培养基中进行初次扩纯培养.将扩纯培养的菌液划线接种于PSE 培养基，37 ℃培养24 h，挑取黑色单菌落，再次进行纯化培养.

1.2.3 革兰氏染色

取纯化培养的细菌进行革兰氏染色，于显微镜油镜下观察其染色特性及形态和排列.

1.2.4 PCR 鉴定

1.2.4.1 引物

粪肠球菌特异性转录调控基因Ef0027，由TaKaRa 公司合成，预扩增片段518 bp［9］.

P1：5′-GCCACTATTTCTCGGACAGC-3′；P2：5′-GTCGTCCCTTTGGCAAATAA-3′.

1.2.4.2 PCR 鉴定条件

采用煮沸法提取细菌基因组DNA，取上清作为DNA 模板.PCR 反应体系为25 μL：其中模板DNA 2 μL， PCR Taq Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，加dd H2O 补至25 μL. PCR 扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 次循环，最后72 ℃延伸10 min.反应完成后取5 μL PCR扩增产物，于浓度为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，通过凝胶成像系统检测PCR 扩增结果.

1.2.5 药敏试验

选取取青霉素、诺氟沙星、头孢曲松钠等38 种抗生素，采用K-B 法对粪肠球菌分离株进行药物敏感性试验.参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2018 标准对粪肠球菌耐药性进行分析.

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

31 份猪直肠粪样于叠氮化钠葡萄糖培养基中37 ℃培养12 h 后，培养基呈均匀浑浊，将样品培养菌液接种于PSE 琼脂培养基，其中15 份样品在PSE 琼脂培养基上有棕黑色、圆形、边缘光滑、表面湿润、不透明疑似粪肠球菌菌落生成，挑取黑色疑似候选菌落进一步扩纯培养.

2.2 细菌革兰氏染色

将分离扩纯培养获得的15 个疑似候选菌进行革兰氏染色，结果呈阳性.在显微镜油镜下观察，菌体呈球形，以短链状排列，无芽孢和荚膜，见图1.

图1 分离菌革兰氏染色结果

2.3 PCR 鉴定

对15 个疑似候选菌落Ef0027 基因进行PCR 扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳分别获得3 条约518 bp的电泳条带，与预期结果一致，见图2.

图2 分离菌株Ef0027 基因PCR 扩增结果

2.4 药敏试验

将PCR 鉴定阳性菌分别进行药敏试验，结果见表1.根据CLSI（2018）判定标准，3 株粪肠球菌对11类38 种药物总耐药率为69.3%，对头孢克肟、羧苄西林、链霉素、林可霉素、四环素等17 种药物均耐药，占总药物数的44.7%，其中分离菌株对磺胺类、林可胺类、苯丙醇类、四环素类、甲硝唑等药物呈100%耐药，对其它药物的耐药率分别为：头孢类83.3%，大环内酯类77.8%，呋喃唑酮66.7%，青霉素类44.4%，氟喹诺酮类和氨基糖苷类41.7%，糖肽类33.3%.结果表明，由该猪场分离的粪肠球菌存在普遍耐药情况，且多重耐药和交叉耐药现象严重.

表1 粪肠球菌分离株药敏试验结果

3 讨论

近年来，动物源粪肠球菌感染日益增多，临床上耐药菌株不断出现，多重耐药现象普遍，相关报道屡见不鲜，对动物性食品卫生安全及人类公共卫生安全构成了极大威胁［10-12］.此外，由于粪肠球菌还编码众多毒力基因，又增加了对该病临床防治的困难［13］.本实验从31 份猪直肠粪样中分离到3 株粪肠球菌，分离率为9.8%，分离株总耐药率为69.3%，耐药率70%以上的抗菌素有磺胺类、林可胺类、苯丙醇类、四环素类、甲硝唑、头孢类和大环内酯类，耐药率40%左右的有青霉素类、氟喹诺酮类、糖肽类、氨基糖苷类及呋喃唑酮，分别占11 大类药物的64.5%和45.5%，结果说明该猪源粪肠球菌对大多数抗菌药呈高度耐药，且多重耐药和交叉耐药现象严重，从而在一定程度上增加了猪场抗感染治疗的难度.

粪肠球菌作为革兰氏阳性菌耐药的指示菌，其耐药机制复杂，存在对某些抗菌药物的固有耐药性及获得性耐药，尤其是耐万古霉素肠球菌（VRE）的快速增加使得VRE 成为临床感染的重要病原菌［14-15］.万古霉素常用于耐药革兰氏阳性菌的治疗，随着糖肽类药物的大量使用，耐万古霉素细菌出现并有增多趋势，VRE 成为临床重点关注的病原菌，其对细菌耐药性检测具有重要意义.本实验发现，此次猪粪肠球菌分离株对万古霉素的耐药率为33.3%，说明该猪场细菌耐药性问题异常严重，已经出现了耐万古霉素的粪肠球菌，应该引起猪场兽医的重视.

细菌耐药性的产生可能和临床长期用药习惯、用药频率及用药方式等因素有关.因此，临床用药应参考药敏试验结果制定合理的给药方案，合理选药，正确用药，持续进行耐药性监测并及时预警，及时调整，以延缓耐药菌株出现，降低细菌耐药性产生机率.

细菌耐药性可通过耐药基因在人和动物之间相互传递，粪肠球菌作为革兰氏阳性菌耐药的指示菌，对动物源粪肠球菌的耐药性分析和研究具有重要意义［16-17］，因此进一步研究其耐药表型和耐药基因型之间的关系对研究粪肠球菌耐药机制和临床防治具有重要意义.