亳菊的离体保存研究

兰 伟，韩 雪

(阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037)

亳菊( Dendranthema morifolium ( Ramat.) Tzvel‘Boju’cv. nov.) 属菊科菊属植物，主产于安徽亳州、涡阳一带，栽培历史悠久，以其优良的品质和显著的药效被《中国药典》(2010 年版)收载为法定中药材，是我国四大名菊之一[1-4]。由于生境范围狭窄，加之菊农为追求短期经济效益选种产量高、色泽好的杭白菊替代亳菊，致使亳菊种质处于濒临灭绝状态。传统的亳菊种质资源保存以大田种植为主，不仅占用土地，易受自然灾害的影响，而且需要大量的人力、物力和财力支持，即便如此，尚无法避免人为失误而造成的品种混杂甚至种性退化的发生。

常规的组织培养保存方式虽然能够克服大田种植保存的弱点，然而继代频繁易使保存的原始种质丧失[5]。

离体保存技术是植物种质资源保存方式之一，已成功应用于蔬菜，果树，观赏植物，药用植物[6]，如: 生姜[7]、猕猴桃[8]、梨[9]、香青 兰[10]、纪伊 潮菊[11]、红根草[12]等，即使是同科同属的植物，属内物种间也存在着不同的储藏特性[13]。目前，国内外对菊花的离体保存报道较少，仅有对切花菊“神马”[14]、菊花[15]及野菊纪伊潮菊[11]的研究。尚无对亳菊离体保存方面的相关研究报道。

本试验旨在研究培养基中不同营养成分和蔗糖浓度对亳菊试管苗离体保存的影响，对保存下来的试验材料进行继代培养，分析其遗传稳定性，为同科同属植物的离体保存提供参考，同时也为其它药用植物离体保存体系的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 材料

试材亳菊来源由亳州沪谯中药饮片厂中药材种植基地提供。2012 年3 月～2014 年9 月，在阜阳师范学院植物组织培养室进行试验。

1. 2 方法

1.2.1 无菌再生体系建立

将亳菊的幼芽流水冲洗5 ～7 min，置入75 %乙醇消毒30 s，倒去乙醇，浸入0.1 %升汞溶液消毒7.5 min，无菌水冲洗3 ～4 次，接种在附加蔗糖30 g·L－1、琼脂6.2 g·L－1、p H 值为5.8 ～6.0 的MS 培养基上，(23 ±2)℃、2 000 ～3 000 lx 光照强度、12 h·d－1的光照培养条件下继代培养30 d 后将萌发的腋芽转移至MS + 0.5 mg·L－16 －BA +0.1 mg·L－1NAA + 30 g·L－1蔗糖+ 6.2 g·L－1琼脂的培养基上进行增殖快繁。

1.2.2 离体保存

取茎秆粗细、节间长度和生长健壮程度基本一致的试管苗，剪取长约1.0 cm，两个节的茎段为试材。以MS 基本培养基附加30 g·L－1的蔗糖为对照，改变培养基蔗糖浓度和培养基养分比例，即在MS 培养基中分别添加(0、15、30、60、90) g·L－1的蔗糖;MS 培养基养分降低为0，1/4MS，1/2MS;1/2MS 培养基中分别添加(0、15、30、60、90)g·L－1的蔗糖，共A、B、C 三组试验，11 种处理。

每种处理培养基作15 瓶处理，每瓶接种3 株。在常温(23 ±2)℃、2 000 ～3 000 lx 光照强度、12 h·d－1的光照培养条件下对试管苗进行离体保存培养。去除污染的处理，随机选取10 瓶，每隔30 d定期观察记录亳菊的生长状况，如: 不同培养基中试管苗的成活率，植株的高度、根数、有无枯叶及枯叶主要生长部位、植株的叶色等。以全株植物完全枯萎变黄记为死亡植株进行统计[12]。

1.2.3 恢复培养及形态学观察

将保存365 d 后存活的试管苗与每60 d 继代1次正常培养的试管苗同时转接到MS 培养基上进行正常培养，30 d 后，观察恢复生长的情况并与正常继代培养的植株进行形态学比较。

2 结果与分析

2.1 蔗糖浓度对试管苗成活率的影响

调节培养基中蔗糖浓度( 表1)，其浓度为0 ～15 g·L－1时，亳菊试管苗保存时间相对于对照组得以延长，保存至365 d 时，仍有88.9 %试管苗存活;在15 ～90 g·L－1范围内，随着蔗糖浓度的升高，保存至120 ～180 d，试管苗存活率逐渐降低，但随着保存时间的延长，附加60 g·L－1蔗糖，试管苗保存时间相对较长，成活率较高(表1)，保存至240 d 时，仍有80 %的试管苗存活。

培养基中蔗糖浓度为时0 g·L－1时，亳菊试管苗茎秆细弱且因生长空间受限而盘曲，叶片大、薄，色浅绿，叶数少，根数也很少，成活率不高，但保存时间相对较长，至240 d，仍有35.6 %的植株存活;培养基中蔗糖浓度较低时(15 g·L－1和30 g·L－1)，保存至180 d，两种处理试管苗存活率与平均株高差异不大，均长势旺盛，植株较高，茎较细，根数较多，叶片较大，叶数较多( 表2)，色泽相对较淡;培养基中蔗糖浓度较高时(60 g·L－1和90 g·L－1)，保存至180 d 后，两种试管苗的存活率与平均株高逐渐降低，植株茎秆加粗，根数显著增多，叶片小而浓密，叶数多，叶色浓绿，生长非常旺盛( 图1)。高浓度蔗糖为试管苗的生长提供了大量碳源的同时，也改变了培养基的渗透压，随着保存时间的延续，植株基部叶片干枯，至240 d 时，添加90 g·L－1蔗糖的培养基中试管苗全部死亡，是因为培养基渗透压过高导致试管苗衰亡; 添加60 g·L－1蔗糖的培养基中的试管苗保存至240 d 存活率为80.0 %。试验结果表明，在一定浓度范围内提高培养基渗透压可以减缓亳菊试管苗吸收作用而延缓植株生长，延长其保存时间;添加30 g·L－1蔗糖的对照组试管苗保存至240 d 时植株全部死亡，是由于试管苗的过度生长而导致养分不足造成死亡。

与对照组MS(30 g·L－1蔗糖) 试管苗相比，蔗糖浓度降至15 g·L－1时，保存时间延长了125 d后仍有88.9 %植株存活。蔗糖浓度提高至60 ～90 g·L－1时，植株色泽加深，株高变矮，叶柄加粗，因生长过度，导致后期时培养基中营养不足而衰老死亡。试验结果表明，MS 培养基附加60 ～90 g·L－1高浓度蔗糖不适于亳菊试管苗离体保存;蔗糖浓度降低为0 ～15 g·L－1时，保存时间得以延长。

表1 不同浓度蔗糖对试管苗的存活率的影响

表2 不同浓度蔗糖对单株试管苗平均叶数的影响

图1180 d 不同蔗糖处理中离体保存植株的生长状况

2.2 培养基营养成分对试管苗成活率的影响

在MS 培养基正常附加30.0 g·L－1蔗糖基础上，其养分减至0、1/2 MS、1/4 MS。随着培养基养分的变化，在不含养分的培养基中，试管苗叶色黄白，茎细，叶而小，不能生长，培养30 d 时即全部量死亡，因为培养基中不能为植株提供所必需的营养成分，植株不能进行正常的生长代谢;1/4 MS 培养基中试管苗茎秆较细，叶较小，叶色较浅，培养至180 d 时，成活率为80.0 %，至240 d 时，植株全部死亡;1/2 MS 培养基中成活率较高，培养至240 d时，成活率为100.0 %，长势旺盛，叶微向下卷曲;对照组MS 培养基中，试管苗前期长势旺盛，但培养至240 d 时，植株全部死亡( 如图2)。试验结果表明，1/2 MS 培养基有利于亳菊试管苗保存。

图2 不同培养基成分对试管苗离体保存的影响(180 d)

2.3 培养基营养成分和蔗糖浓度对试管苗成活率的影响

在(23 ±2)℃、2 000 ～3 000 lx 光照强度、12 h·d－1的光照培养条件下，降低培养基养分为1/2 MS 的同时，增加或降低蔗糖浓度，蔗糖浓度为0 ～15 g·L－1，试管苗存活率逐渐升高，保存时间得到延长。在蔗糖浓度15 ～90 g·L－1范围内，存活率逐渐降低，保存时间缩短(表3)。平均株高随蔗糖浓度(30 ～90 g·L－1)的升高而逐渐降低。

蔗糖浓度0 g·L－1时，试管苗茎细弱而盘曲，叶片大、薄，色浅绿，叶数少，根数也很少，成活率不高，但保存时间相对较长，至365 d 时仍有少量植株存活;蔗糖浓度较低时(15 g·L－1)，保存至365 d，试管苗存活率为88.9 %，长势旺盛，植株较高，茎较细，根数较多，叶片较大，叶数较多，色泽相对较淡(表4); 蔗糖浓度为30 g·L－1时，生长旺盛，茎叶颜色较绿，在保存180 d 时成活率仍为100%;蔗糖浓度较高时(60 g·L－1和90 g·L－1)，两种试管苗的存活率与平均株高较对照组1/2 MS( 蔗糖30 g·L－1)降低，但长势非常茂盛，植株茎秆加粗，根数非常多，叶片小而浓密，叶数多，叶色浓绿( 图3)。高浓度蔗糖为试管苗的生存和生长提供了大量的碳源，随着保存时间的延续，基部叶片干枯，至120 d 时，90 g·L－1的蔗糖浓度中试管苗全部死亡，60 g·L－1中的植株也开始大面积死亡。这是由于植株的过度生长而衰老死亡造成的。对照组试管苗保存至240 d 时植株全部死亡。

与对照组1/2 MS(30 g·L－1) 中试管苗相比，蔗糖浓度降至15 g·L－1时，保存时间延长了125 d后，88.9 %试管苗存活; 降至0 g·L－1，保存时间延长了125 d 后，存活率大大降低; 蔗糖浓度提高至60 ～90 g·L－1时，植株色泽加深，株高变矮，叶柄加粗，根非常多，植株因生长过度，生长后期，试管苗因养分不足而衰老死亡。

试验结果表明，在1/2 MS 培养基中，添加15 g·L－1蔗糖有利于亳菊试管苗离体保存，可有效延长其保存时间。

表31 /2 MS 培养基中添加不同浓度的蔗糖对试管苗存活率的影响

表41 /2 MS 培养基中不同浓度的蔗糖对单株试管苗平均叶数的影响

图31 /2 MS 培养基中不同蔗糖处理的试管苗保存180 d 的生长状况

2.4 恢复培养

保存365 d 的试管苗转接至继代培养基上后恢复生长正常( 如图4)，保存植株的增殖倍数、植株形态学特征、生根状况等与每60 d 继代1 次正常培养的试管苗相比无显著差异。

图4 试管苗保存365 d 恢复生长情况

3 讨论

改变培养基的营养成分或者蔗糖的浓度来限制或延缓试管苗的生长，能够达到延长保存时间的目的[16]。蔗糖是试管苗培养过程中不可缺少的碳源和能量。A 组试验中，培养基中蔗糖为0 g·L－1时，30 d 后试管苗存活率为80.0 %，随着保存时间的延长，存活率降低，这可能是培养前期，试管苗自身具有的碳水化合物提供了植株生长所需的能量，故成活率不高，随着培养时间的推移，试管苗通过光合作用合成的能量维持了生命的延续，故植株生长缓慢，长势弱，这与纪伊潮菊的研究结果一致[11];添加较低浓度蔗糖( 15 g·L－1和30 g·L－1)，存活率大大提高，保存至365 d ，仍有88.9%试管苗存活，这与纪伊潮菊、铁皮石斛上的研究结果基本相同[11，17]。添加较高浓度蔗糖(60 g·L－1和90 g·L－1)，试管苗新陈代谢加快，生长量加大，养分消耗加快，试管苗存活率较高，当培养基中的养分不能维持植株生长需要时，试管苗便开始衰老，直至死亡。另外，蔗糖增加了培养中的渗透压，浓蔗糖度较高时，试管苗生长健壮，蔗糖浓度超过一定限度，高渗条件下导致细胞膨压降低，阻碍了植株正常吸收水分和养分，从而生长不良，这与生姜、铁皮石斛上的研究结果一致[7，17]。

调整培养基养分水平是一种重要的限制试管苗生长技术。在红根草保存培养过程中，1/2 MS培养基对红根草保存最好[12]。在B 组试验中，1/ 2 MS 培养基中，亳菊试管苗保存时间最长，240 d 成活率为100.0 %; MS 培养基亳菊试管苗保存达240 d;1/4 MS 培养基中亳菊试管苗保存180 d即出现衰老死亡。1/2 MS 培养基为试管苗生长提供了维持生命最基本的养分，但因养分受限而使其生长过缓。

在C 组试验中，通过降低培养基成分与调节蔗糖浓度，即在1/2 MS 基础培养基中加入0 ～90 g·L－1的蔗糖，试管苗成活率和保存时间有很大不同。培养基中无蔗糖的情况下，试管苗依赖光合作用合成的能量物质也能够维持较长时间，但毕竟合成的能量有限，试管苗生长势较差;在1/2 MS 培养基中加入15 g·L－1蔗糖时，保存时间最长，长势最好，成活率最高，可能是由于低成分培养基和较低浓度蔗糖发生交互作用，使保存时间得以延续，这与红根草的研究结果保持一致[12]。另外，在本试验观察过程中，影响试管苗死亡的主要因素除生长过快、养分不足和培养基渗透压过高等原因之外，试管苗衰老过程中通过根系向培养基分泌有害代谢废物，可能也加剧了植株的死亡。因此，在亳菊试管苗保存过程中，控制根的生长也是很重要的。通过调节蔗糖浓度及降低培养基成分等手段开展了亳菊离体保存研究，延长了试管苗保存的时间，如果把此种方法与低温处理或生长延缓剂等再结合处理，进一步延长亳菊的保存时间，还有待于进一步研究。

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