Lactobacillusfermentum Zhao的小鼠抗皮肤老化效果

周小芳，易若琨，赵　欣

(重庆第二师范学院 生物与化学工程系，重庆 400067)



LactobacillusfermentumZhao的小鼠抗皮肤老化效果

周小芳，易若琨，赵欣

(重庆第二师范学院 生物与化学工程系，重庆 400067)

本文对LactobacillusfermentumZhao(LF-Zhao)的抗老化效果进行研究。体外抗氧化实验结果显示 LF-Zhao具有较强的DPPH自由基和·OH清除能力。进一步的动物实验表明，LF-Zhao可以提高D-半乳糖诱导氧化小鼠血清和皮肤组织中的SOD、GSH-Px水平和降低NO、MDA水平，且随着LF-Zhao浓度的增加效果更为明显。通过RT-PCR实验分析小鼠皮肤组织发现，LF-Zhao能上调氧化小鼠皮肤的nNOS、eNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT mRNA表达和下调iNOS表达，高浓度的LF-Zhao使以上表达最接近正常组小鼠。通过这些结果可以得出LF-Zhao具有良好的皮肤抗老化作用。

牦牛酸乳；Lactobacillus fermentum Zhao；氧化；老化；小鼠

牦牛是分布在我国青藏高原地区的一种特有畜牧资源，其中牦牛酸乳中含有丰富的营养物质，发酵过程中产生的活性物质和发酵中的菌群都对牦牛酸乳保健效果产生影响。特别是牦牛酸乳中的乳酸菌群种类主要受各地区牧民生活习惯，挤奶及发酵的器具，发酵温度、时间等因素的影响，故从牧区的牦牛酸乳分离出的乳酸菌与常用的商业乳酸菌有很大区别[1]。目前有大量的研究表明，乳酸菌在食品行业中具有很广泛的作用，现已被应用在发酵等食品工业相关领域[2-5]，但我国工业中生产发酵乳制品所用的绝大部分乳酸菌均来自国外，因此国内学者已经开始对青海、西藏和甘肃等地区牦牛发酵乳中含有的微生物进行了分离、鉴定，旨在发现具有我国自主知识产权的、保健功能显著的乳酸菌[6-8]。

研究表明乳酸菌对人体有较多的益处，可以促进营养物质的吸收[9]；改善人体胃肠道功能，抑制腐败菌的繁殖，清除肠道垃圾[10]；增强人体免疫力和抵抗力；消除人体内自由基，具有抗衰老的作用[11]。进一步的研究表明乳酸菌有较强的抗氧化作用，对于控制氧化导致的机体异常具有一定的帮助[12]。本研究团队对藏区牦牛酸乳进行了初步研究，分离鉴定出具有知识产权的乳酸菌菌株。通过动物实验对已鉴定的牦牛酸乳分离乳酸菌LactobacillusfermentumZhao的皮肤老化预防效果进行了研究，实验结果为食品和保健品行业进一步利用LactobacillusfermentumZhao积累了理论依据。

一、材料与方法

(一)材料与试剂

菌株：乳酸菌LactobacillusfermentumZhao(LF-Zhao)分离自四川红原县自然发酵的牦牛酸乳(中国典型培养物保藏中心菌种保藏号：M2013513)。

DPPH试剂，上海金穗生物科技有限公司；NO、SOD、GSH-Px、MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所；EDTA，Sigma公司，美国；CycleTESTTM PLUS DNA染色试剂盒，Becton Dickinson公司，德国；Trizol试剂、oligodT18、RNase、dNTP 和MLV，Invitrogen公司，美国；RT-PCR引物nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT，天根生化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

(二)实验动物

雄性SPF级KM小鼠40 只(体重20～25 g)，购自重庆医科大学实验动物中心(合格证号：SYXK(渝)2012-0001)。

(三)仪器与设备

LD2X-50FB立式压力蒸汽灭菌锅，江西华科精密仪器有限公司；PYX-DHS-50X65BS隔水式电热恒温培养箱，上海百典仪器设备有限公司； UV9600紫外分光光度计，北京北分瑞利分析仪器(集团)公司；Bio-Rad小型水平电泳槽，Bio-Rad公司，美国 ABI 2720 PCR仪, 美国Applied Biosystems公司。

(四)方法

1. DPPH自由基清除能力的测定

将4mL的LF-Zhao菌液(浓度为1.0×107、1.0×108CFU/mL)和1mL的DPPH(1.5×10-4M)试剂混合后室温放置30min，最后在517nm处读得吸光度，计算得到DPPH 自由基清除能力[13]。

2. ·OH清除能力的测定

配制测定反应体系(1.4mL)，包含0.2mL的LF-Zhao菌液(浓度为1.0×107、1.0×108CFU/mL)，脱氧核糖(6mM，0.2mL)，0.2mL的磷酸钠缓冲液(20mM，pH 7.4)，0.2mL无水氯化铁(FeCl3，400μM)，0.2mL的硫酸亚铁-乙二胺四乙酸(EDTA，400μM)，0.2mL的H2O2(3mM)和0.2mL抗坏血酸(400μM)。在37℃水浴中保温60min后，在反应体系液中加入1mL的三氯乙酸和1mL的硫代巴比妥酸后，在90℃水浴中加热20min。最后在532nm处测定吸光度测后计算·OH清除能力[13]。

3. 动物抗老化实验

KM小鼠喂养1周适应环境后平均分为4组，分别是正常组、老化对照组、LF-Zhao低浓度组和LF-Zhao高浓度组，每组10只小鼠。正常组除外其余3组每只小鼠每日按浓度120mg/kg腹腔注射D-半乳糖，持续6周。注射D-半乳糖的同时，LF-Zhao低浓度组(1.0×107CFU/mL)和LF-Zhao高浓度组(1.0×108CFU/mL)小鼠每日灌胃0.2mL的LF-Zhao，同样持续6周。6周后对小鼠实施绝食24h后乙醚处死小鼠并解剖，心脏取血，皮肤组织待用[13]。

4. 血清和皮肤组织NO、SOD、GSH-Px和MDA含量测定

将取得的血浆在4000rpm下离心分离10min后取上层血清，按试剂盒说明书测定小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA的含量。将小鼠皮肤组织制成10%的匀浆后在4000rpm下离心分离10min，取上清液按试剂盒说明书测定皮肤组织指标。

5. RT-PCR实验分析皮肤组织

用RNAzol 试剂提取皮肤组织中的总RNA，然后将其浓度稀释到1μg/μL。在RNA 提取液(2μL)中按次序加入1μL的 oligodT18，RNase, dNTP 和MLV 酶，10μL的5×buffer，然后合成cDNA(37℃ 120 min，99℃ 4min，4℃ 3 min)。然后以反转录-聚合酶链反应法扩增nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达，同时GAPDH(持家基因)作为内参照同样进行扩增。最后以琼脂(含1%浓度溴化乙锭)电泳检查PCR扩增产物，并用Image1.44软件定量分析表达强度[13]。

(五)数据统计

所有的实验均进行3 次平行实验，然后使用SAS9.1 统计软件采用one-way ANOVA 分析方法分析各组数据在p<0.05 水平上是否具有显著差异。

二、 结果与分析

(一)LF-Zhao的体外抗氧化效果

通过预实验发现LF-Zhao的抗氧化效果在浓度0-1.0×108CFU/mL呈现线性增长，因此本研究选择浓度1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao进行体外和动物体内的抗氧化效果研究。实验结果显示1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao具有较强的DPPH自由基清除能力，1.0×107CFU/mL的LF-Zhao对DPPH自由基清除能力为47.5±3.8%，浓度提高到1.0×108CFU /mL时对DPPH自由基清除能力达到84.5±4.2%。同时，1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao对·OH清除能力也呈现出和DPPH自由基清除能力相同的趋势，分别达到52.1±3.3%和88.6%±3.5。DPPH自由基清除能力和·OH清除能力的测定可以有效地对食品的体外抗氧化效果进行检测[14]，由本实验的结果可以看出LF-Zhao具有很强的体外抗氧化效果，且随着浓度的提高，抗氧化效果也随之提高。

(二)LF-Zhao对小鼠NO、SOD、GSH-Px和MDA含量的影响

由表1和表2可知，灌胃LF-Zhao的小鼠血清和皮肤组织中的NO、MDA含量较仅诱导老化的老化对照组小鼠低，而SOD、GSH-Px含量更高。同时，不同浓度LF-Zhao灌胃小鼠体内的NO、SOD、GSH-Px和MDA含量也产生一定的差异，1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠血清中的NO和MDA含量显著低于老化对照组小鼠，而SOD、GSH-Px含量显著高于老化对照组小鼠，且1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA水平比1.0×107CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠的水平更接近正常组小鼠。LF-Zhao灌胃小鼠皮肤组织中的NO、MDA、SOD、GSH-Px含量表现出和血清指标相似的状态，NO和MDA的含量高于正常组，SOD和GSH-Px的含量低于正常组，高浓度的LF-Zhao能使老化皮肤中的NO、MDA、SOD、GSH-Px含量更接近正常组。一氧化氮在体内是由一氧化氮合酶(NOS)催化下产生的, 在体内各生理系统和组织中均有十分重要的作用，一定量的NO起到维持体内老化平衡的作用，当机体收到老化损伤时，NO在NOS的作用下大量产生，是机体失衡的表现[15]。本研究也得到了相似的结果，老化对照组小鼠由于氧化损伤导致NO的含量异常上升，LF-Zhao可以缓解这种异常的NO含量上升，且高浓度的LF-Zhao具有更显著的效果，意味着LF-Zhao具有较强的动物体内抗老化效果。SOD和GSH-Px作为评价体内抗氧化的重要标准已得到证明，高含量的SOD和GSH-Px证明抗氧化效果的优异；同时MDA是脂质过氧化的重要表现，其含量越低证明机体收到脂质过氧化导致老化的影响越小[16]。本研究中LF-Zhao可以起到缓解氧化造成的SOD、GSH-Px含量下降和抑制MDA含量的升高，且高浓度的LF-Zhao效果最好。

表1　不同浓度LF-Zhao灌胃小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA含量

不同字母表示比较各组数据平均值显著性差异(p<0.05)，表2，图1、2同。

表2　不同浓度LF-Zhao灌胃小鼠皮肤组织中NO、SOD、GSH-Px和MDA含量

(三)不同浓度LF-Zhao对小鼠皮肤组织中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表达的影响

通过PT-PCR实验结果可以看到，LF-Zhao灌胃小组小鼠皮肤组织中的nNOS、eNOS表达显著高于老化对照组，但低于正常组，同时皮肤组织中的iNOS表达呈现与nNOS、eNOS表达相反的趋势，显著低于老化对照组(见图1)。然而，LF-Zhao灌胃小鼠的nNOS、eNOS表达显著高于老化对照组小鼠，1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠的nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表达比1.0×107CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠更为接近正常组小鼠。体内的NO失衡是机体损伤的标志之一，NO在体内是由NOS催化产生的，其中iNOS在正常情况下不表达，机体氧化损伤后，iNOS大量转化成NO，使机体氧化损伤加重；nNOS和eNOS在机体多个组织中均体现出氧化受损后下降的趋势，可见nNOS、eNOS表达减弱，iNOS表达增强是氧化损伤的重要体现[17]。

图1　Lactobacillus fermentum Zhao灌胃小鼠皮肤组织中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表达水平

(四)不同浓度LF-Zhao对小鼠皮肤组织中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达的影响

实验结果显示LF-Zhao灌胃可以显著提高老化损伤小鼠皮肤组织中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达(见图2)，起到抗老化的作用，且高浓度的LF-Zhao的效果更为优异，其皮肤组织中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的表达强度更为接近正常组小鼠。SOD在动物体内有三种异构体，Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和EC-SOD，体内的Mn-SOD和Gu/Zn-SOD水平过低会导致自由基的大量产生，对机体造成老化损伤。CAT作为生物防御体系中的关键酶之一，能清除氧自由基和促进过氧化氢分解，从而避免氧化对体内细胞的老化损伤[18]。

图2　Lactobacillus fermentum Zhao灌胃小鼠皮肤组织中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达水平

三、结语

本研究对不同浓度的LF-Zhao的抗老化效果进行研究，通过体外和动物体内实验证明LF-Zhao具有显著的抗老化效果。不同浓度的LF-Zhao均能够清除DPPH自由基和·OH。动物实验也证明受到D-半乳糖诱导老化的小鼠在灌胃LF-Zhao后体内NO和MDA含量下降，SOD和GSH-Px含量上升。进一步通过RT-PCR实验观察小鼠肝组织中mRNA表达的变化发现，LF-Zhao可以上调氧化损伤小鼠的nNOS、eNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT表达和下调iNOS表达。根据这些结果可以得出结论：LF-Zhao可以产生较好的抗老化效果。

[1]张丽.传统发酵牦牛奶中益生乳杆菌筛选及其免疫调节功能研究[D].兰州:甘肃农业大学,2011.

[2]于岚,沈伟达,阳大海,等.开菲尔粒中发酵优势菌混合发酵生产开菲尔饮品的研究[J].安徽农业科学,2012,40(4):2289-2291.

[3]罗珍兰.酵母菌在发酵乳制品中的有益作用[J].中国乳品工业,1996,24(2):31-33.

[4]董喜梅,包艳,张勇,等.国内外发酵豆乳研究发展现状[J].大豆科学,2010,29(5):883-888.

[5]张逊,姚文,朱伟云.肠道大豆异黄酮降解菌研究进展[J].世界华人消化杂志,2006,14(10):973-978.

[6]陈芝兰,程池,马凯,等.西藏地区牦牛发酵乳制品中乳酸菌的分离与鉴定[J].食品科学,2008,29(12):408-412.

[7]倪慧娟.新疆地区和青海地区传统发酵乳制品中酵母菌的生物多样性[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2009.

[8]李银聪.自然发酵酸牦牛奶的微生物区系及其抗氧化活性研究[D].重庆:西南大学,2011.

[9]Kim Y, Yoon S, Lee SB, et al. Fermentation of Soy Milk via Lactobacillus Plantarum Improves Dysregulated Lipid Metabolism in Rats on a High Cholesterol Diet[J].PLoSOne, 2014, 9(2): e88231.

[10]Chen WC, Quigley EM. Probiotics, Prebiotics & Synbiotics in Small Intestinal Bacterial Overgrowth: Opening up a New Therapeutic Horizon![J].IndianJournalofMedicalResearch, 2014, 140(5): 582-584.

[11]Patten DA1Laws AP. Lactobacillus-produced Exopolysaccharides and Their Potential Health Benefits: a Review[J].BeneficialMicrobes, 2015, 7: 1-15.

[12]王志锋,周雨霞,侯先志,等.乳酸菌对人结肠癌细胞系HT-29的黏附[J].乳业科学与技术,2005,4:149-150.

[13]Wang H, Gao XD, Zhou CC, et al. In Vitro and in Vivo Antioxidant Activity of Aqueous Extract from Choerospondias Axillaris Fruit[J].FoodChemistry, 2008, 106(3): 888-895.

[14]黄占旺，上官新晨，程军辉，等.纳豆混合发酵技术研究[J].中国食品学报，2005,5(4):70-73.

[15]钟萍，李萍，张昕蕾.当归多糖对小鼠化学性肝损伤抗氧化酶及一氧化氮含量的影响[J].现代预防医学,2011,38(22):4725-4727.

[16]万全，王艳梅，林琳，等.黄缘盒龟多肽对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠抗氧化能力的影响[J].现代食品科技,2013,29(9):2075-2080.[17]Darra E, Rungatscher A, Carcereri de Prati A, et al. Dual Modulation of Nitric Oxide Production in the Heart during Ischaemia/reperfusion Injury and Inflammation[J].ThrombosisandHaemostasis, 2010, 104(2): 200-206.

[18]Ligumsky M, Sestieri M, Okon E, et al. Antioxidants Inhibit Ethanol-induced Gastric Injury in the Rat: Role of Manganese, Glycine, and Carotene[J].ScandinavianJournalofGastroenterology, 1995, 30(9): 854-860.

[责任编辑刘江南]

2016-04-11

重庆第二师范学院学生科研项目(2014036)

周小芳(1993— )，女，在读本科生，研究方向：功能性食品；通信作者：赵欣(1981—)，男，教授，理学博士，研究方向：功能性食品。

TS201.4

A

1008-6390(2016)05-0160-04