紫山药组织培养及褐化因素的研究

王碧琴，朱 祺，刘腾云，李彦强，周 华

(江西省科学院生物资源研究所，江西 南昌330029)

0 前言

紫山药(Purple yam)，别名薯蓣，属薯蓣科(Dioscoreaceae)山药属(Dioscorea L.)，是一年生或多年生缠绕性藤本植物，能形成肥大的地下肉质块茎供为食用或药用。我国是山药重要原产地和驯化中心，紫山药属于山药的紫红肉品种群，在我国南方的浙江、福建、江西等地有大面积栽培。

紫山药通常以块茎切成6～10 cm长带隐芽表皮的块茎(约80 g)，可直接栽种或育苗移栽。由于长期的块茎繁殖和耕地的连作，植株遭受到病毒病侵染，以致种性退化，品质下降，产量降低，感病株率上升。随着农药化肥的大量施用，病毒病不但得不到控制，而且更加严重至蔓延，危及到整个产业以致某些优良品种濒临灭绝。

紫山药通过茎尖脱毒培养不但能去除植株体内的病毒或减少病毒，而且能使优良品种种性得以保存延续［1，2］。但山药在组织培养过程中存在着严重的褐化发应，经常发现山药组培苗或外植体枯死及其基部培养基颜色黑褐化，这种褐化现象又称为酚污染，严重影响外植体的脱分化和培养物的再分化［3］。到目前为止，山药(紫山药)组织培养研究仅限于少量的实验室阶段，还末涉及到快繁体系方面的研究。因此，本着紫山药组织培养快繁体系的建立，生产组培试管苗，尽快转化应用田间，笔者就目前紫山药组织培养过程中的褐化现象及有效控制等方面进行了研究探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫山药(紫玉红)嫩茎尖、茎段。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基 初始诱导分化培养基:MS6BA 0.5～2.0 mg/L+NAA 0.1～0.5 mg/L或培养基附加Vc、PVP、AC 0.01～0.2 g/L，以上培养基含45 g/L食用糖，琼脂6 g/L，pH5.8。

1.2.2 外植体消毒和接种 茎段和茎尖消毒:去掉展开的叶片分别剪成带叶柄的茎段、茎尖，用洗液清洗.分别用0.1%Hgcl浸泡消毒。茎尖5 min，茎段10 min然后用无菌水冲洗数次。消毒好的材料备用。

(1)茎尖和茎段的初始培养:茎段0.8～1.0 cm，茎尖0.5～0.8 cm分别接种于初始培养基上每处理重复3次，培养30 d后统计成活率(成活率=枯死数/接种数×100%)。

(2)激素浓度对茎尖、茎段的诱导分化:茎段0.5 cm，茎尖0.3 cm左右接种在诱导分化培养基上每处理重复2次。40 d后观察变化，统计诱导分化率及不定芽增殖数(诱导分化率=萌芽数/接种数×100%，不定芽增殖数=培养物萌发新的芽体数)。

(3)培养周期对茎尖、茎段诱导分化:茎尖0.3 cm，茎段0.5 cm分别接种在诱导分化培养基上，每处理重复2次，培养20 d为继代周期，继代4次并统计不定芽增殖数。

(4)抗褐化剂Vc、PVP、AC筛选及对茎尖、茎段诱导分化影响:培养一个周期，观察培养物生长状况和培养基褐化的程度。比较不同抗氧化的效果及组培苗生长状况。

以上培养温度25±2℃，光照1 200 lx，10 h/d。

2 结果与分析

2.1 茎尖、茎段的诱导培养

茎段带节间0.8～1.0 cm(72段)，茎尖0.5～0.8 cm(30个)分别接种于初始培养基上培养，2－3 d培养物基部开始变褐，褐色物渗入培养基呈圆形并遂步扩散，10－15 d左右外植体基部褐化加重，部分茎尖变褐整个枯死，茎段基部1/3处枯死。培养20 d统计茎尖平均枯死率在17%，茎段枯死率在7%。外植体培养20 d后基部的茎节处肿大并有淡红色圆形芽点;茎段叶柄张开腋芽开始萌动，30 d左右茎段叶腋抽生1～2个不定芽0.5～2.5 cm，稍嫩的茎段叶腋形成0.1～0.2 cm小瘤状物，初始培养茎尖、茎段的成活率分别是43%和91%。

2.2 6-BA浓度对茎尖、茎段的诱导分化影响

茎尖0.3 cm(12个)、茎段0.5 cm(30段)分别接种在1、2、3、4、5诱导分化培养基上，培养3－5 d茎段切口处分泌褐色物扩散培养基由浅褐致深褐，10－15 d茎段基部增粗叶柄张开，腋芽萌发单个或多个不定芽小点，单个不定芽伸长生长较快，20 d左右不定芽基部生长1～3条淡红色不定根，不定根生长伸长较茎快，直接伸入培养基，分泌酚类化合物受多酚氧化酶激活产生醌类物质，加重了培养基褐化程度，15－20 d不定根2～4 cm长，不定芽2.0 cm长，随着激素浓度的加大茎段形成的丛生芽体数增多，最多可达5～7个不等。茎尖由于个体小分化的芽点也小，虽然分化率高但能形成正常的小芽少，随着培养时间延长部分小芽可生长成正常芽，但芽体较弱、矮小或畸型。实验表明6-BA 1.0 mg/L下有利培养不定芽。

2.3 培养周期对茎尖、茎段诱导分化影响

茎尖0.3 cm(30个)茎段0.5 cm(30个)接种诱导分化培养基上，每培养20 d后继代相同培养基并统计增殖的小芽，茎段培养15－20 d后不定芽由茎段基部叶腋隐芽分化或由腋芽直接分化形成不定芽;此时茎尖仅在叶腋处膨大露出小小的芽点。2次继代后茎段不定芽0.5～1.0 cm长，40 d不定芽增殖数达到高峰，增殖数由(20 d) 23＜(40 d)42＞(60 d)15＞(80 d)11遂步下降，随着培养时间增加，不定芽增多，形成多个多芽体，茎节处有少量的不定根，茎段第3次继代苖高为2.0～4.0 cm，基部1～2节处有多条不定根，并有多芽体丛生现象。此时基部不定芽的分化基本停止，但茎腋处仍产生重叠多芽体，致使芽体茎杆细小或丛枝状，不利于作次代增殖材料。不定芽增殖数随培养时间延长由少量增多至高峰后到回落，实验表明，在一定的时间内茎尖、茎段培养增殖数(20 d)0＜(40 d)27＜(60 d)40＞(80 d) 34，培养60 d为不定芽增殖数最高值。

2.4 Vc、PVP、AC筛选及茎尖、茎段诱导分化影响

紫山药外植体茎尖、茎段在诱导培养基中添加一定量的抗氧化剂Vc、PVP、AC时所产生的效果差异显著。抗坏血酸(Vc)对茎尖、茎段外植体培养过程中没有抑制褐化的效果，但对培养基凝固有负作用。茎尖在PVP、AC培养基培养随着抗氧化剂量的增加，死亡率增加。这是因为在培养过程中培养物对培养条件有敏感拮抗效应，加上外植体接种后由自养变为异养，细胞代谢发生变化，产生了一些酚类化合物，这些酚类物质受多酚氧化酶激活，被氧化后产生醌类物质，醌类物质呈粽褐色随着外植体的伤口或愈伤组织遂步从组织扩散到培养基中，影响了外植体器官的分化，以致幼芽体不能正常的机理代谢而死亡。PVP、AC对茎段培养有抗褐化能力，能抑制褐化物质进一步扩散，维持茎段幼芽体正常萌芽生长。这是因为茎段组织具有完备成熟的机理系统，在抗氧化物质的作用下对自生系统的调节，对物体基部的褐化－醌类物质受到阻隔，在一定的范围内扩散，不影响茎段的正常生长。这种不同的效果与外植体自身的生理结构－植物受体部位内源物质的含量有密切关系。

PVP、AC对茎尖、茎段外植体培养过程中有抑制或延迟褐变的效果。

3 小结

褐变是指植物组织培养过程中，由于外植体组织被切割和接种快繁时，损伤切面细胞中酚类物质在酚氧化酶的作用下与氧气聚合而发生氧化反应，形成有毒的醌类物质。外植体切面迅速变成棕褐色或暗褐色，并逐步扩散至培养基中，抑制其它酶的活性，导致组织代谢紊乱，生长受抑制，最终致使外植体死亡［4］。

(1)紫山药细胞组织含有极高量的酚类物质，因此外植体在接种后需多次的更换培养基，减少褐化物的累积，保持培养物的正常生长环境。

(2)据资料“6－苄基腺嘌呤和激动素浓度高也有诱导褐化的作用”。培养基中的高激素浓度有加剧外植体褐变的因素，实验表明，在茎段诱导分化培养基激素浓度越高褐化越重。由此，6-BA激素浓度在1.0 mg/L有利于器官的正常分化。

(3)试验证明，在一定的范围内激素浓度与茎尖、茎段诱导分化率成正比，激素浓度越高分化的不定芽越多，继代次数越多产生不定芽多芽体也多，尤其在不定芽2次继代后比较明显，这与晏婴才的盾叶薯蓣组织培养与快速繁殖研究激素组合对多芽体的影响结论基本相似。

［1］ 颜昌敬.植物组织培养手册［M］.上海:上海科学技术出版社，1990.

［2］ 蔡建荣，曾 军，张志勇，等.怀山药茎段组织培养及增殖的研究［J］.福建农业科技，2002，(2):14－15.

［3］ Mager AM，Harel.Polyphenol Oxidases in plants［J］.Phytochemistry，1979，18:193－215.

［4］ 蔡建荣.山药茎段愈伤组织褐变与外源药物抑制效应的研究［J］.浙江农业科学，2008，(5):523－525.