磷脂酶D的紫外诱变选育及发酵条件的优化

刘媛媛，张小里，姚 娜，李红亚，赵彬侠

（西北大学化工学院，陕西 西安 710069）

磷脂酶D的紫外诱变选育及发酵条件的优化

刘媛媛，张小里，姚 娜，李红亚，赵彬侠

（西北大学化工学院，陕西 西安 710069）

磷脂酶D在催化磷脂酰基交换反应中具有重要的应用价值。本文对产磷脂酶D野生链霉菌株进行紫外诱变，筛选得到一株产酶活力提高42.5%的变异株。通过摇瓶培养，对发酵条件进行探究。确定的最佳培养基组成为：葡萄糖10.0 g/L，牛肉膏和蛋白胨各5.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl23.0 g/L，NaCl 2.0 g/L；表面活性剂Tween80对产酶有促进作用，其适宜浓度为0.60 g/L。在上述条件下，摇瓶发酵产酶活力达3.23 U/mL。

磷脂酶D；诱变；磷脂酰基转移；发酵

磷脂酶D（phospholipase D，EC3.1.4.4，简称PLD)，即磷脂酰胆碱水解酶，能催化水解卵磷脂（PC）释放出磷脂酸和胆碱，在醇类物质存在下，一些PLD亦能催化磷脂酰基转移反应，将具有羟基的底物与胆碱的极性头部进行交换反应，生成新磷脂[1-3]。PLD催化的磷脂酰基转移反应可合成许多稀有或半合成磷脂，广泛应用于食品、医药等领域。据报道，稀有链霉菌株是磷脂酰基转移活力PLD主要生产菌，然而，野生菌株的酶产量普遍很低[4]。

本工作利用前期筛选得到的一株产磷脂酰基转移活力 PLD野生链霉菌株，通过紫外诱变筛选育种，改良菌株的产酶能力；并且，对所筛选高产菌株发酵生产磷脂酶D的最佳工艺条件进行探究。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

磷脂酶D产生菌Streptomyces PLD0606，由本实验室保藏。

1.1.2 培养基

孢子萌发培养基（g/L）：酵母浸粉 10.0；蛋白胨 10.0；CaCl2，0.01 mol/L。

PDA 培养基（g/L）：马铃薯 200.0；葡萄糖20.0；琼脂 20.0。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖 10.0；蛋白胨 7.5；酵母浸膏 20.0；K2HPO42.0；MgSO4·7H2O 0.5；pH值 6.8～7.2。当探索最佳条件时，组分及浓度进行必要调整。

1.1.3 试 剂

薄层层析硅胶板（GF254），青岛海洋化工集团；琼脂粉（BR），北京奥博星生物技术有限责任公司；蛋白胨（BR），天津市大茂化学试剂厂；磷脂酰基对硝基酚（p-PNP）为本实验室合成。其它试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 单孢子悬液的制备

原始菌株于 PDA斜面培养基上 28 ℃培养 7天，无菌水洗孢子，转至带玻璃珠的试管充分震荡，滤纸过滤。调整孢子浓度为107个/mL数量级。

1.2.2 孢子预萌发及诱变剂量的确定

将1 mL单孢子悬液加入到装有5 mL萌发培养基的摇瓶中，摇床培养，经过0、2 h、4 h、6 h后分别取样，于培养皿中紫外线照射2 min测算孢子致死率。结果表明培养4 h的孢子悬液对紫外线最敏感，最适宜紫外线处理。在相同条件下制备敏感孢子悬液，紫外线照射一定时间后，暗培养7天后，统计致死率，确定适宜的诱变剂量。

1.2.3 诱变处理

按照上述方法处理，采取先紫外照射30 s，然后置于日光灯下光修复30 min，再在紫外灯下照射90 s。28 ℃避光培养3天后，再取出正常培养4天。

1.2.4 突变株的筛选

从培养 7天的诱变平板上挑选单菌落接种斜面，培养后，摇瓶发酵测定PLD水解活力进行初筛；测定磷脂酰基转移活力进行复筛。

1.2.5 传代稳定性试验

将突变株进行连续传代，测定PLD发酵水平，并以第一代为基准进行相比较。

1.2.6 PLD活力测定

PLD水解活力以p-PNP为底物依分光光度法测定[2]。磷脂酰基转移活力以 PC转化为磷脂酰乙醇胺（PE）的反应测定，PC及PE浓度以氯仿-甲醇-水（13:5:0.8，体积比）为展开剂、GF254硅胶板TLC测定；碘蒸气染色的薄层板用图像处理软件测量斑点面积及灰度值，计算出磷脂组分浓度。酶蛋白质浓度依 Bradford法以牛血清蛋白为标准进行测定[5]，并用于PLD比活力测定。

2 结果与讨论

2.1 紫外诱变剂量

链霉菌PLD0606经过紫外线照射不同的时间，在28 ℃下培养7天后，统计其致死率，结果见表1。由表1可见，致死率随紫外线照射时间加长而增加，90～120 s时致死率达90%左右。故选择紫外线照射120 s作为适宜的诱变剂量，此时的正突变率一般较高。

表1 链霉菌紫外诱变致死率

2.2 突变株的筛选

如表2所示，挑取经过紫外诱变的不同形态单菌落接种斜面，发酵测试酶产量进行初筛和复筛。发现与原始菌落（编号 0）形状相同、但孢子饱满的变异株PLD产量显著增加。菌落形态均呈梅花褶皱型，但变异株产 PLD磷脂酰基转移活力提高约42.5%。

2.3 传代稳定性结果

传代试验结果如表3所示，表明此突变株具有较为稳定的遗传性能，高产磷脂酶D性能在菌株传代保藏和培养发酵过程中不易丢失，具有应用价值。

表2 紫外诱变结果

表3 传代次数与相对酶活的关系

2.4 氮源对发酵产酶的影响

在预实验中已确定适宜碳源为葡萄糖10.0 g/L的基础上，研究牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、花生粉、黄豆粉等常见复合氮源对变异株产 PLD的影响。选择牛肉膏15.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，牛肉膏、蛋白胨各7.5 g/L时，菌丝生长情况及酶活力如表4所示。在相同浓度下，不同的天然有机氮源对链霉菌产酶影响效果并不显著，均能被链霉菌充分利用，其菌丝生长情况良好。当选用牛肉膏+蛋白胨复合有机氮源时，酶活力比用单一氮源牛肉膏或蛋白胨时有所提高，但提高效果并不明显。

图1描述了牛肉膏、蛋白胨作混合氮源时，其浓度对PLD相对活力的影响。在用量均为5.0 g/L时相对酶活力达到最大。

2.5 无机盐对产酶的影响

发酵培养基中的其它组分不变，分别对CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl三种无机盐进行单因素实验，考察对链霉菌发酵产酶的影响。结果如图2所示，三种无机盐均对产酶有显著影响，当 CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl浓度分别达到为 3.0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L时产酶效果最好。

表4 不同天然氮源对链霉菌发酵产酶的影响

图1 氮源浓度对链霉菌发酵产酶的影响

图2 不同种类无机盐浓度对链霉菌产酶的影响

2.6 表面活性剂对产酶的影响

表面活性剂能改变细胞膜透过性，从而有利于胞内酶扩散至培养基中。本文选用Tween 60、Tween 80、PEG 2000、Span五种表面活性剂试验对链霉菌产酶的影响，其浓度均为0.2 g/L，实验结果图3所示。由图3可以看出，Span和Tween 80对链霉菌产酶有一定的促进作用，而Tween 80的作用较为明显。

图4即显示不同Tween 80浓度对链霉菌产酶的影响。由图4可知，当Tween 80达到最佳的添加剂量0.6 g/L时，PLD相对活力最大。而后，当继续加大表面活性剂的用量时，酶活力基本不变。

适宜氮源、无机盐浓度下，结合表面活性剂作用，本文摇瓶发酵最好水平对应的PLD活力达3.23 U/mL。

3 结 论

图3 表面活性剂种类对链霉菌发酵产酶的影响

图4 Tween80不同浓度对链霉菌产酶的影响

通过紫外诱变改良，得到一株PLD高产菌株，酶活力相较原始菌株提高了约42.5%，传代稳定性良好。对变异株发酵条件进行了优化，实验结果表明，培养基成分对产酶效果有一定影响。天然氮源牛肉膏与蛋白胨等量配合，浓度各为5.0 g/L时产酶效果较好；无机盐 CaCl2、MgSO4·7H2O、NaCl，浓度分别为3.0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L效果较佳；表面活性剂Tween80对产酶有促进作用，其适宜浓度为0.6 g/L。优化条件下，摇瓶发酵磷脂酶D活力达到3.23 U/mL。

[1] 陈石良，许正宏，孙微.磷脂酶D的研究进展[J].工业微生物，1999，29（4）：47-50.

[2] Paola D，Arrigo，Valentino Piergianni，et al. A spectrophotometric assay for phospholipase D[J].Analytica Chimica Acta，1995，304（2）：249-254.

[3] Paola D，Arrigo，Trefano Sevi. Using phospholipases for phospholipids modification[J]. Tibth March，1997，15（3）：90-96.

[4] Yoshiko Uesugi，Tadashi Hatanaka. Phospholipase D mechanism using Streptomyces PLD[J].Biochimica et Biophysica Acta，2009，1791（9）：962-969.

[5] Tsaffrir Z，Selinger Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity：Theoretical and experimental studies[J].AnalyticalBiochemistry，1996，236：302-308.

Ultraviolet mutagenesis breeding and fermentation conditions of phospholipase D producing strain

LIU Yuanyuan，ZHANG Xiaoli，YAO Na，Li Hongya，Zhao Binxia
（School of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China）

Phospholipase D (PLD) catalyzed transphosphatidylation reaction plays an important and useful role in synthesis of phospholipids. In the present paper，a PLD-high-producing strain was selected by ultraviolet mutagenesis from wild Streptomyces and its PLD activity was increased by 42.5% against the original strain. The PLD producing conditions for the mutant strain was investigated in shake flask fermentation. The optimized components (g/L) of culture medium were 10.0 of glucose，5.0 of beef extract，5.0 of peptone，1.0 of MgSO4·7H2O，3.0 of CaCl2，and 2.0 of NaCl. The enzyme productivity could also be enhanced by the supply of surfactant i.e. Tween 80，and its optimal concentration was 0.6 g/L. Under the above conditions，3.23 U/mL of enzyme activity was achieved in 500 mL of shake flask fermentation.

phospholipase D；mutagenesis；transphosphatidylation；fermentation

TQ 925+9

：A

：1000-6613（2012）09-2036-04

2012-04-16 ；修改稿日期：2012-05-11。

陕西省科技攻关计划（2004K08-C24）及陕西省教育厅产业化项目（04JC05）。

刘媛媛（1987—），女，硕士研究生。联系人：张小里，教授，博士生导师，研究方向为生物催化过程、催化反应工程。E-mail xlzhang@nwu.edu.cn。