Box-Behnken法优化不同孔径MCM-41包载β-胡萝卜素的处方工艺

刘静，翟婷婷，于晓倩，王海媛，任智慧，晋兴华



Box-Behnken法优化不同孔径MCM-41包载胡萝卜素的处方工艺

刘静，翟婷婷，于晓倩，王海媛，任智慧，晋兴华

（天津大学药物科学与技术学院，天津 300072）

采用三水平三因素的Box-Behnken实验设计，利用响应曲面法对影响MCM-41包载胡萝卜素包封率的主要因素进行研究，主要考虑的影响因素有载药时间、扩孔剂含量、胡萝卜素/MCM-41投药比等，以MCM-41对胡萝卜素的包封率作为评价因素，建立相应的数学模型，优化处方。结果表明，最优的处方工艺是载药时间为20h、扩孔剂含量为0.6mL、胡萝卜素/MCM-41投药比为3。在此条件下，胡萝卜素的包封率可达理论预测值的95.83%，说明将Box-Behnken实验设计法用于MCM-41包载胡萝卜素处方的优化筛选是可行的，且得到的实验观察值与数学模型的预测值相符合。

MCM-41；胡萝卜素；Box-Behnken实验设计

胡萝卜素是Wakenroer于20世纪30年代从胡萝卜中发现的一种天然色素[1]。大量研究证实，胡萝卜素的生理活性已被越来越多地证实并应用于疾病的预防和治疗。胡萝卜素是维生素A的主要来源[2]，它具有清除自由基和高效淬灭单线态氧的作用，具有很强的抗氧化性，且对人体免疫系统有增强作用。但是，胡萝卜素的结构中含有多个双键，具有化学不稳定性，氧气、光辐射、酸、碱、高温、水分等都是影响其稳定性的因素。并且胡萝卜素不溶于水，微溶于油，使得其生物利用度很低，大大限制了其应用[3-6]。因此寻找增加其溶解性和稳定性的包载材料非常重要。由于介孔分子筛材料MCM-41具有比表面积大、无毒副作用、生物兼容性良好等特点[7-9]，故本实验考虑采用MCM-41来包载胡萝卜素以增加其生物利用度。但目前尚未有利用介孔分子筛MCM-41对脂溶性色素胡萝卜素进行包载的研究。

响应曲面法（response surface methodology，RSM）是现代统计与数学的集成方法，被广泛应用于响应变量与自变量函数关系研究中[10]。响应曲面分析法采用多元二次回归方程拟合各因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析以寻求最佳工艺参数，解决多变量的一种统计方法。Box-Behnken 实验设计（BBD）是RSM中常用的实验设计方法之一。BBD是一种基于三水平的二阶实验设计法，其所有试验点均落在安全操作范围之内，试验次数相对较少，效率更高。故本实验采用Box-Behnken设计来优化不同孔径的MCM-41包载胡萝卜素的处方工艺。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：胡萝卜素，纯度>82%，天津光复精细化工研究所；正硅酸乙酯（TEOS），分析纯，天津市博迪化工有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），分析纯，天津光复精细化工研究所；NaOH，分析纯，天津市江天化工技术有限公司；超纯水，Milli-Q Academic；甲醇，色谱纯，天津康科德科技有限公司；氯仿、丙酮、无水乙醇等均为分析纯。

仪器：Agilent Cary 60紫外分光光度计；Agilent 1200高效液相色谱仪；Anke TGL-16G高速台式离心机；KE-BEI型电热恒温水浴锅；Mettler toledo XS105型电子天平；SX2-4-10马弗炉，天津天有利科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同孔径MCM-41的制备

制备不同孔径MCM-41的各原料的摩尔比为：CTAB∶TMB∶7.564 TEOS∶2.551 NaOH∶4652 H2O (/= 1，2，3)。具体制备过程如下：用量筒量取360mL超纯水置于500mL三口瓶中，加热到80℃后，在搅拌的条件下向三口瓶中加入1.5g CTAB，搅拌均匀后加入5.25mL 2mol/L NaOH溶液，搅拌反应3min，溶液呈均相后，向三口瓶中加入适量扩孔剂1,3,5-三甲基苯（TMB），并缓慢加入7.5mL TEOS，保持80℃温度下不断搅拌反应2h。反应后溶液冷却至室温，抽滤泵进行抽滤，并分别用水和无水乙醇洗涤3次，65℃下过夜干燥。将得到的MCM-41放入马弗炉中，550℃下煅烧5h，得到不同孔径的MCM-41。根据加入的扩孔剂的量不同，得到的MCM-41分别记作M1、M2、M3。

1.2.2 β-胡萝卜素的组装

胡萝卜素的组装采用溶剂浸渍法。分别称取0.5g M1、M2、M3不同孔径的介孔分子筛，加入到一定浓度的胡萝卜素的氯仿/丙酮（体积比9∶1）溶液中，密封，避光，放入37℃恒温震荡器中震荡一定时间后，10000r/min离心3min，取上清液，用紫外分光光度法测定胡萝卜素的包封率，胡萝卜素的最大吸收波长为445nm。根据式（1）测定胡萝卜素的包封率。

=×100% （1）

式中，为胡萝卜素的包封率；总为加入的胡萝卜素的总质量；游离为离心后上清液中剩余的胡萝卜素的质量。

2 结果与讨论

2.1 MCM-41的表征

2.1.1 FT-IR谱图

图1为合成的不同孔径的介孔分子筛M1、M2、M3在去除模板后的傅里叶变换红外光谱图，波数区间为400～4000cm−1。在图谱上，950cm−1处的特征吸收峰体现了端基硅羟基的对称伸缩振动；与硅骨架有关的谱峰出现在1096cm−1和810cm−1两处，分别为硅氧键Si—O—Si不对称与对称伸缩振动；460cm−1处的谱峰为Si—O键的弯曲振动。从以上分析可知，加入扩孔剂后得到的不同孔径的介孔分子筛仍保持良好的介孔孔道结构。

2.1.2 TEM

图2是合成的不同孔径的介孔分子筛M1、M2、M3的透射电镜照片，可以看出，加入扩孔剂后合成的介孔分子筛颗粒形状规整，大小均匀，晶粒尺寸约为200nm，球形度良好。图2(d)为M2的高倍透射电镜照片，图中可以清晰地看到介孔分子筛规整的孔道结构。

2.1.3 N2吸附-解吸附

从图3可知，制备的不同孔径的介孔分子筛的N2吸附-解吸附等温线均属于Ⅳ型等温线，是介孔材料典型的吸附等温线。对比图3 中M1、M2、M3可以发现，加入扩孔剂后得到的介孔分子筛的3条等温线均出现了一个滞后环，这说明扩孔剂的加入并没有改变材料的孔道结构，材料均具有圆柱形细长孔道结构。与透射电镜的分析结果相互印证。且随着加入扩孔剂的含量的不同，介孔材料的氮气吸附量有少量增加，这是因为加入的致孔剂使材料的孔容增大，因而进入孔道的氮气量会有所增加。

从表1中可以看出，MCM-41的比表面积均比较大，在1000m2/g左右。介孔材料的孔径在2～10nm，并且随着扩孔剂的加入量逐渐增大，制备的介孔分子筛的孔径逐渐增大、孔容积增加、比表面积逐渐减小。

表1 介孔材料结构参数

2.2 浸渍溶剂的选择

考察了4种常见的浸渍溶剂[氯仿、丙酮、二氯甲烷以及氯仿-丙酮（体积比9∶1）]对于胡萝卜素包封率的影响。设定胡萝卜素-MCM-41（质量比1∶1）于37℃恒温震荡器中震荡24h，离心，吸取上清液，测定胡萝卜素的包封率，结果见图4。浸渍溶剂筛选的原则主要是在对胡萝卜素有一定溶解度的基础上，恰当的溶剂介电常数能够增加溶剂在介孔分子筛中的渗透性，因此筛选出合适的 介电常数的溶剂有利于提高胡萝卜素的包封 率[11-12]。由图4分析可知，当单独采用丙酮作为浸渍溶剂时，虽然丙酮的极性较大，但对胡萝卜素的溶解度较低，故胡萝卜素的包封率低；当单独采用二氯甲烷作为浸渍溶剂时，虽然二氯甲烷的极性比较适中，但是胡萝卜素在二氯甲烷中的溶解度大，胡萝卜素与二氯甲烷的相互作用较强，使得其很难在介孔分子筛与溶剂之间达到分配平衡，胡萝卜素的包封率较低；当单独采用三氯甲烷作为溶剂时，由于其溶解性适中，只是极性略小，得到的胡萝卜素的包封率已经有较大程度的提高，但为了进一步提高三氯甲烷作为浸渍溶剂时胡萝卜素的包封率，选择采用混合溶剂，将三氯甲烷与丙酮按照9∶1的比例混合，在尽可能保持胡萝卜素在混合溶剂中的溶解度的前提下，改善三氯甲烷的极性，提高胡萝卜素的包封率。

2.3 单因素试验

2.3.1 载药时间的影响

在胡萝卜素-MCM-41（1∶1）、浸渍溶剂为氯仿-丙酮（体积比9∶1）的条件下，考察了不同的载药时间对于胡萝卜素包封率的影响，结果见图5。由图5可知，当载药时间在16h左右时，曲线发生突跃，这可能是由于MCM-41的介孔孔径与胡萝卜素分子之间的吸附-解吸附过程达到平衡，胡萝卜素分子开始进入到介孔孔道内，故当载药时间>16h时，胡萝卜素的包封率逐渐增加，24h以后，胡萝卜素的包封率略有降低，可能的原因是介孔孔道是开放性孔道，载药时间过长会导致胡萝卜素的泄漏。故载药时间应控制在16～24h。

2.3.2 β-胡萝卜素与MCM-41质量比的影响

在浸渍溶剂为氯仿-丙酮（9∶1）、载药时间为20h的条件下，考察了胡萝卜素与MCM-41质量比对胡萝卜素包封率的影响，结果见图6。

由图6可知，随着胡萝卜素与MCM-41质量比的增加，胡萝卜素的包封率逐渐增加，这是由于当增加胡萝卜素与MCM-41质量比时，介孔孔道内外的胡萝卜素的浓度差逐渐增大，则进入到介孔孔道中的胡萝卜素也随之增加。然而，胡萝卜素的浓度越大，由于MCM-41巨大的比表面积，胡萝卜素会吸附于MCM-41的表面而未能进入到介孔孔道中，则会造成测定的胡萝卜素的包封率不准确。

2.3.3 扩孔剂含量的影响

在浸渍溶剂为氯仿-丙酮（9∶1）、载药时间为20h的条件下，考察了加入不同量的1,3,5-TMB对胡萝卜素包封率的影响。

由图7所示，当加入的扩孔剂的用量逐渐增加，胡萝卜素的包封率随之增加，但当扩孔剂的用量到达一定值后，则胡萝卜素的包封率基本不再发生改变。这是由于当增加扩孔剂用量时，MCM-41的孔径增大，能够容纳的胡萝卜素分子就越多，但1,3,5-TMB的扩孔能力是有限的，过量的扩孔剂会使MCM-41的结晶有序度下降，故扩孔剂只能够使胡萝卜素的包封率在一定范围内增加。

2.4 实验设计

实验采用Design-Experts 8.0.6软件中的Box-Behnken 实验设计，在单因素考察的基础上，选取对胡萝卜素的包封率影响较为显著的3个因素，即扩孔剂含量() ，胡萝卜素与MCM-41的质量比()以及载药时间()，在3个水平上进行了研究，以胡萝卜素的包封率作为响应值，进行3因素3水平的响应曲面实验（表2）。

表2 Box-Behnken设计的因素与水平

（1）二次回归模型的建立 实验结果见表3。利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行响应曲面分析，求得回归方程为：=52.72−1.67+ 30.12+1.87−1.01−2.84−0.11−6.242+4.142−2.112。

表3 Box-Behnken实验设计结果

（2）方差分析和显著性检验 回归方程的各项方差分析结果见表4。拟合的一元二次方程的相关系数2= 0.9957。值为206.74，0.05>值（<0.0001），显著性检验表明，该回归方差达到极显著水平。而失拟项=1.52，明显小于3,2=19.2，说明模型的拟合度良好，可以用此模型来对MCM-41包载胡萝卜素的处方进行分析及预测。方程中的一次项对胡萝卜素包封率的影响达到了较为显著的水平，二次项对胡萝卜素包封率的影响则表现的更为显著，交互项中只有的交互作用对于胡萝卜素包封率的影响有显著影响，这均说明自变量与响应值之间并不能用简单的线性关系来表述。

表4 回归方程各项的方差分析

（3）响应曲面分析 通过模型方程得到响应曲面图和等高线图，结果见图8～图10。胡萝卜素- MCM-41的质量比对胡萝卜素的包封率影响十分显著，并且扩孔剂的含量与载药时间的交互作用对胡萝卜素的包封率影响最为显著。

由图8～图10分析可知，利用不同孔径MCM-41包载胡萝卜素的最佳条件为载药时间为20.66h、扩孔剂用量为0.6mL、胡萝卜素/MCM-41为2.96。在该条件下，胡萝卜素的包封率可达到85.85%。

2.5 验证实验

在得到的最佳包载条件下，重复3次实验来比较实验值与预测值的吻合度，结果见表5。由表5可知，吻合度可达95.83%，证明了回归模型的可行性。因此采用响应曲面法优化得到的MCM-41包载胡萝卜素的参数基本准确可靠，具有一定的实用价值。

表5 验证实验结果

3 结 论

首次利用介孔二氧化硅微球作为载体包载胡萝卜素，并结合响应曲面法对该处方工艺进行了优化，获得了良好的结果。在实验过程中发现，当利用不同孔径的MCM-41对胡萝卜素进行包载时，扩孔剂的含量与载药时间的交互作用对于胡萝卜素的包封率具有显著的影响。最佳的包载条件为：载药时间为20.66h，扩孔剂含量为0.6mL，胡萝卜素/MCM-41为2.96。在该条件下，胡萝卜素的包封率可达理论预测值的95.83%。利用介孔二氧化硅微球作为载体包载胡萝卜素可以为胡萝卜素的新剂型研究提供新的实验依据。

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Optimization ofcarotene loaded MCM-41 mesoporous silica by Box-Behnken design

LIU Jing，ZHAI Tingting，YU Xiaoqian，WANG Haiyuan，REN Zhihui，JIN Xinghua

（School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

To optimize the formulation parameters of beta-carotene loaded MCM-41 mesoporous silica for the maximum encapsulation efficiency，experiments were designed according to a three-level，three-variable Box-Behnken design (BBD). Independent variables were the amount of pore enlarging agent ()，the beta-carotene/MCM-41 mass ratio ()，and loading time ()，and the response variable was the encapsulated efficiency of beta-carotene (EE). The optimal formulation parameters were as follows：，andlevels were 0.6mL，3 and 20h，respectively. The observed responses agree with the predicted values of the mathematic models，and the Box-Behnken design is suitable for optimizing the formulation of beta-carotene loaded MCM-41 mesoporous silica.

MCM-41；carotene；Box-Behnken design

R 914.2

A

1000–6613（2015）09–3392–07

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.09.030

2015-01-09；修改稿日期：2015-02-06。

刘静（1990—），女，硕士研究生。联系人：晋兴华，博士，讲师。E-mail snail9006@163.com。