蜡状芽孢杆菌菌株SMC的间甲酚降解特性及动力学

于晨阳，毛缜

（中国矿业大学(徐州)环境与测绘学院，江苏 徐州 221116）

间甲酚作为我国优先控制污染物甲酚的三种同分异构体中的一种，毒性最大且最难降解，是有机化工中一种重要的原料，已经广泛地应用于人类日常生活中，由于其具有强烈的毒性和腐蚀性且在环境中持久存在，已被美国EPA 列入环境优先控制污染物的黑名单。我国地表水环境质量标准中规定Ⅴ类水中挥发酚含量最高是1.0mg/L，同时在《污水综合排放标准》中明确规定间甲酚最高允许排放浓度不超过0.5mg/L。因此，有效去除间甲酚对保护环境和人类健康而言是刻不容缓的。

目前含酚废水的生物降解法相对于其他物化处理方法，具有经济、安全、残留少、无二次污染等方面的优点，且在应用方面更显优势。但由于焦化、石化、制药等行业排出的废水中多元酚的浓度很 高[1]，其毒性会令很多微生物的生长和降酚活性受到抑制，导致传统的生物法在去除高浓度的间甲酚方面效率偏低，而高效菌投加技术可以很大地发挥微生物的潜力，能够有效地解决难降解的问题，所以分离高效降解菌株也受到了国内外学者们的广泛重视。付柳等[2]以间甲酚为基质分离出复合菌种CDMs，当间甲酚初始浓度为551mg/L 时，完全降解所需时间为65h，而600mg/L 的间甲酚在65h 内降解率仅为2.67%。Jiang 等[3]通过对野生热带假丝酵母菌进行氦氖激光辐射诱变获得突变菌株CTM2，该菌株在5%的接种量下能降解300mg/L 的间甲酚，而在共基质生物降解系统，0～500mg/L 浓度的苯酚能促进CTM2 对间甲酚的降解，在苯酚以350mg/L 浓度存在时，300mg/L 的间甲酚能在46h被完全降解。Pichiah Saravanan 等[4]从污水处理厂分离出一个混合菌群，在27℃、150r/min、接种量为1%条件下，间甲酚初始浓度为300mg/L 时能够达到最大降解速率，完全降解100mg/L 的间甲酚所需时间为14h，但当初始浓度为900mg/L 时完全降解需要136h。由此可见，虽然国内外文献已有间甲酚降解菌株的报道，但是这些菌株耐受与降解的间甲酚浓度并不高。对于间甲酚生物降解代谢途径方面的研究大致分为3 类：邻位代谢途径、间位代谢途径和龙胆酸代谢途径[5]。 邻苯二酚是芳香烃类化合物降解的重要中间产物，因为几乎所有的芳香烃类化合物都是先降解为邻苯二酚，而后邻苯二酚通过邻位或间位双加氧酶的作用进行裂解使苯环断裂。

本实验以焦化厂活性污泥作为原始菌源，旨在驯化筛选出一株以间甲酚为唯一碳源且具有高效降解能力的菌株，并对其降解特性以及降解动力学进行研究，以此为生物降解法提供高效降解菌菌源。同时，通过预测菌株降解间甲酚的趋势来优化生化处理的工艺条件，从而为提高菌株对间甲酚的降解效率方面提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

活性污泥取自圣戈班（中国）投资有限公司（原徐州钢厂）焦化车间废水处理站活性污泥。

驯化培养基由无机盐溶液中添加一定浓度的间甲酚配制而成。各种无机盐的含量为：KH2PO4，1.0g/L；K2HPO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.4g/L；CaCl2，0.01g/L；NaCl，0.6g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；FeCl3·6H2O，0.02g/L；NH4Cl，0.8g/L；间甲酚（200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1600mg/L、1800mg/L）。

1.2 菌种的驯化、筛选和分离

采用逐量分批驯化法进行驯化，取5mL 原始菌源接入装有50mL 无机盐培养基的三角瓶中（其中间甲酚浓度为50mg/L），共接2 瓶。一瓶置于恒温振荡器中于30℃、150r/min 条件下培养，另一瓶置于4℃冰箱中不培养。经48h 培养后，将培养与不培养的三角瓶同时取出，摇匀。若培养瓶中液体浑浊度高说明已有菌增殖，则从培养瓶中取5mL 作为菌源接入50mL 间甲酚浓度为100mg/L 的无机盐培养基中，重复上述培养与检查。按照上面方法，不断提高间甲酚在无机盐培养基中的浓度，间甲酚的浓度分别为200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1600mg/L、1800mg/L，培养瓶中液体在间甲酚浓度为1800mg/L 不再变浑浊，所以取间甲酚浓度为1600mg/L 的无机盐培养基中培养48h 后的菌源进行稀释涂布和划线，挑取不同的单菌落，将所得单菌落分别接入以1600mg/L 间甲酚为唯一碳源的50mL 无机盐培养基中，培养48h后测定间甲酚剩余浓度，选取间甲酚降解率最大的菌株为驯化筛选得到的高效降解间甲酚菌株。

1.3 菌种鉴定

使用UNIQ-10 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒来提取菌株SMC 的基因组DNA。对提取的菌株基因组DNA 进行PCR 扩增，PCR 扩增仪程序设定的扩增反应条件如下：预变性94℃ 5min；循环94℃ 30s，55℃ 35s，72℃ 1min，35 个循环后于72℃再延伸8min。PCR 产物经过琼脂糖凝胶电泳后利用UNIQ-10 柱式DNA 胶回收试剂盒回收。回收的产物送到上海生物工程服务有限公司进行16S rDNA序列的测定，并进行序列Blast 比对分析，取其近缘菌的16S rDNA 序列构建系统发育树。

1.4 分析方法

菌体浓度采用光密度法，即采用可见分光光度计，在600nm 波长下测定菌悬液的吸光度（OD600）来代表间甲酚降解菌的浓度。吸光度值越高说明培养基中的菌体质量浓度越高。间甲酚浓度采用采用4-氨基安替比林法[6]。根据吸光度和间甲酚含量的标准曲线得出样品间甲酚的浓度，从而计算样品中间甲酚的降解效率。

1.5 间甲酚降解菌降解特性分析

分别考察温度、pH 值、摇床转速、氮源的种类对间甲酚降解率的影响，进而确定菌株降解间甲酚的最适环境条件。测定菌株对间甲酚降解能力的试验在最适降解条件下进行，取1%培养到对数期的菌株，接种到以不同间甲酚初始浓度为唯一碳源的无机盐培养基中培养，定时测定间甲酚残余浓度。 1.6 间甲酚的降解动力学

由于间甲酚为有毒化合物，高浓度间甲酚的存在会对菌体的生长产生抑制作用，目前的研究中，很多学者[7-10]都采用Haldane 模型来描述间甲酚为底物时菌体的生长动力学。在本实验中也观察到了明显的底物抑制作用，故也选择Haldane 模型来模拟在以间甲酚为唯一碳源时菌株的降解动力学行为。方程式为式（1）。

式中，μmax为细胞最大比生长速率，h-1；μχ为菌体的比生长速率，h-1；Ks为菌体生长半饱和系数，mg/L；S 为底物的浓度，mg/L；Ki为底物抑制系数，mg/L。利用MATLAB 软件对μ 和S 作非线性最小二乘回归分析，从而得到μmax、Ks和 Ki的值。

2 结果与讨论

2.1 菌种的分离与鉴定

用以间甲酚为唯一碳源的无机盐培养基进行菌种的驯化，培养48h 后，在间甲酚浓度为1600mg/L的培养基上筛选出一株降解率达到97.8%的高降解率的菌株，将其命名为SMC。

该菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上30℃恒温培养24h 后的菌落为浅黄色的圆形菌落，直径达2.5～5mm，表面凸起有光泽，边缘光滑，再培养一段时间后观察到边缘变粗糙。通过革兰氏染色后观察该菌颜色呈紫色，为革兰氏阳性菌。菌株SMC基因组DNA 经过PCR 扩增后产物的电泳图谱如图1 所示。根据菌株SMC 测定的16S rDNA 序列与Genebank 中已报道的16S rDNA 序列进行同源性比较，利用MEGA 软件构建Neighbour-Joining 树，结果表明菌株SMC 的16S rDNA 序列与在Genebank登记Bacillus cereus（蜡样芽孢杆菌）同源性相似度达到99.7%，初步证明菌株SMC 为Bacillus 属。系统发育树见图2。

目前，国内外许多学者在筛选间甲酚高效降解菌方面也做了大量工作，已筛选出多种间甲酚降解微生物。包括姜岩等[3]发现的热带假丝酵母菌、宋正光等[8]报道的麦芽糖假丝酵母菌、白静[9]报道的粪产碱杆菌、彭丽花等[11]报道的Citrobacter farmeri、吴坤等[12]报道的杂色云芝（Coriolus versicolor），但关于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）菌株降解间甲酚的报道还没有。本文作者在对与间甲酚结构具有较高相似性的苯酚的降解研究中却发现有不少学者分离出芽孢杆菌属的菌株，如Arutchelvan 等[13]分离到的Bacillus brevis 菌株、袁利娟等[14]分离到的Bacillus sp. JY01、李淑彬等[15]分离到的Jp-A 和于彩虹等[16]筛选出的B3 与本实验菌株SMC 同属于蜡状芽孢杆菌（ Bacillus cereus），由此推测芽孢杆菌属菌株同样适用于苯酚的降解。有研究表明，该菌也能以甲苯、氯酚类和硝基酚类等芳香烃类物质作为唯一碳源生长[15]。同一微生物体可以降解多种芳烃可使该微生物具有适应复杂的污染环境的优势，因此对于成分复杂的含酚工业废水，高效广谱的降解菌的筛选在含酚工业废水的处理方面十分重要，而这正可以体现出芽孢杆菌属的SMC 菌株降解含酚工业废水的优越性。

图1 菌株SMC PCR 产物电泳图谱

图2 菌株SMC Neighbour-Joining 树

2.2 环境因素对间甲酚降解的影响

2.2.1 温度对菌株SMC 降解间甲酚的影响

将菌株SMC 在富集培养基中培养至对数期，以1%接种量接种到以1600mg/L 间甲酚为唯一碳源的无机盐培养基中，在不同温度下（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、150r/min 气浴恒温振荡中培养24h 后测定间甲酚残留浓度。

由图3 可以看出，在20～35℃范围内，间甲酚的降解率都在90%以上，说明菌种都能有效地降解间甲酚，其中30℃时菌种降解率最高。在小于20℃或大于35℃时，菌株SMC 对间甲酚的降解效果明显的降低，这是由于超出适宜的温度都会抑制微生物的生长。低温会降低微生物的代谢活性，而过高的温度会导致代谢过程中所需的酶失活或变性，以致无法实现对间甲酚的代谢。故本实验中菌种最适温度为30℃。

2.2.2 pH 值对菌株SMC 降解间甲酚的影响

分别调节以1600mg/L 间甲酚为唯一碳源的无机盐培养基的pH 值为3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11，将菌株SMC 在富集培养基中培养至对数期，以1%接种量接种，30℃、150r/min 气浴恒温振 荡中培养24h 后，测定间甲酚残留浓度。

图3 温度对间甲酚降解率的影响

结果如图4 所示，当pH 值在6～7.5 之间，间甲酚降解率随pH 值升高而不断增大；pH 值在7.5～9 之间时，降解率变化缓慢，基本保持平稳，但降解率均达到90%以上，pH 值为7.5 时降解效果最好；当pH 值大于9 以后，间甲酚降解率呈迅速下降之势。培养基以NH4Cl 作为氮源，在菌种对氮源需求下，细胞会吸收离子NH4+，使得无机盐培养基中pH 值会下降，所以随着培养基初始pH 值逐渐升高，酸性得到中和而减弱对降酚作用的影响。但当培养基过于偏碱时，菌株仍会受到碱性侵害，影响正常的生理活动，从而导致降解率下降。故本实验中菌种采用最适pH 值为7.5。

2.2.3 摇床转速对菌株SMC 降解间甲酚的影响

将菌株SMC 在富集培养基中培养至对数期，以1%接种量接种到以1600mg/L 间甲酚为唯一碳源的无机盐培养基中，在30℃、不同摇床转速下（0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、200r/min）气浴恒温振荡中培养24h 后，测定间甲酚残留浓度。

结果如图5 所示，摇床转速可在某种程度上反映菌种对溶解氧的需求[11]，提高摇床的转速可以提高菌株SMC 的间甲酚降解率。这可能是由于转速的加快提高了菌体同间甲酚的接触面积和氧气传递速率，但是达到150r/min 以上时，对降酚率的影响不大，但当转速大于200r/min 有可能会影响细菌对底物在降解前的吸附从而降低降解效率[11]。考虑动力的因素，本实验摇床最佳转速确定为150r/min。

图4 pH 值对间甲酚降解率的影响

图5 摇床转速对间甲酚降解率的影响

2.2.4 不同间甲酚初始浓度对菌株SMC 降解能力的影响

将菌株SMC 在富集培养基中培养至对数期，以1%接种量接种到以不同初始浓度间甲酚为唯一碳源的无机盐培养基中，在最佳培养条件下，30℃、150r/min 气浴恒温振荡中培养，定时取样，测定间甲酚剩余浓度，绘制间甲酚降解曲线。

结果如图6 所示，初始浓度为1000mg/L、1200mg/L、1400mg/L、1600mg/L、1800mg/L 的间甲酚，降解率达95%所需时间分别为16h、24h、32h、46h、70h。而且菌株SMC 在48h 内对初始浓度为1600mg/L 的间甲酚降解率达到97.81%，初始浓度为1800mg/L 的间甲酚经过菌株72h 的降解，降解率能达到98.06%。但初始浓度为1900mg/L 时，培养基中菌浓度逐渐减少，而且降解效果在72h 后依然不明显，降解率仅为5%左右。因此认为菌株SMC对间甲酚最大耐受能力为1900mg/L。查阅文献，发现目前发表的间甲酚降解菌株的间甲酚耐受浓度没有本实验获得的菌株SMC 高，且降解间甲酚的性能也没有菌株SMC 好[2，3，12-13，17]。由此可以看出，SMC 具有很强的降解间甲酚的能力，是一株间甲酚高效降解菌。

2.3 间甲酚降解动力学方程

图6 菌株SMC 不同间甲酚初始浓度的降解曲线

图7 不同间甲酚初始浓度对菌株比生长率的影响

通过MATLAB 软件对实验数值进行非线性最小二乘回归，得到 Haldane 方程的动力学参数为：μmax=0.01252h-1，KS=34.58mg/L，Ki=479.5mg/L，相关系数R2=0.932。拟合曲线和实验值的对比见图7。从图7 可以看出，理论值和实验值拟和较好，菌体 的比生长速率随着底物浓度的增加呈现先增大后减小的趋势，所得的动力学方程也能较好地描述实验中的反应趋势。有研究证明，Ks值较低而Ki较高的菌株，其耐受性和降解能力都会更好[18]。本研究中的菌株SMC 的Ks值比之前报道的菌株更低，而且Ki值更高[7-10]。这和前面得出的该菌种有着高的降解性和耐受力的结论显然是符合的，而且这种耐受特性正是由该菌种的遗传特性所决定。

3 结 论

（1）从某焦化厂活性污泥中分离到一株能利用间甲酚作为唯一碳源生长的菌株SMC，属革兰氏阳性菌，对其16SrDNA 序列进行分析，初步确定为Bacillus cereus（蜡样芽孢杆菌）。

（2）SMC 降解间甲酚的最佳条件：温度为30℃，pH 值为7.5，转速为150r/min。在最佳降解条件下，该菌株在48h 内对浓度1600mg/L 的间甲酚降解率达97.81%，72h 内对浓度为1800mg/L 的间甲酚降解率达98.06%，得到菌株SMC 对间甲酚的最大耐受能力为1900mg/L。

（3）按照Haldane 模型进行非线性最小二乘曲线拟合，得到菌株SMC 降解间甲酚的动力学参数为μmax=0.01252h-1，KS=34.58mg/L，Ki=479.5mg/L，由拟合曲线的趋势再次证明菌株SMC 对高浓度间甲酚具有较高的耐受性和较好的降解能力。因此，该菌株有可能成为工业含酚废水生物降解法的强化菌株，有进一步研究开发的价值。

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