硅藻土负载异养硝化-好氧反硝化菌的脱氮性能

乔楠，陈瑞佳，于大禹

（1 东北电力大学建筑工程学院，吉林 吉林 132012；2 东北电力大学化学工程学院，吉林 吉林 132012）

随着环境水体富营养化问题的日益严重，人们对排放污水的脱氮问题愈加重视。近年来，一种新型脱氮菌，即异养硝化-好氧反硝化菌逐渐成为污水脱氮领域的研究热点。该菌可同时将硝化和反硝化过程在一个反应器中完成，克服了传统脱氮工艺高成本、高耗能、低效率等问题，因此具有很大的研究价值和应用前景。

目前，已陆续有不同分属的异养硝化-好氧反硝化菌如不动杆菌、红球菌、枯草芽孢杆菌等被从不同环境中分离出来[1-2]。对其开展的研究也多集中于菌株的脱氮特性及机理，有研究者对一株好氧反硝化菌H1 的脱氮性能及机理进行了初步研究[3]，发现在有氧条件下，该菌可在氨单加氧酶的作用下将NH4+-N 氧化为NH2OH，再经过羟胺氧化酶的作用将其转化为N2O，以气体形式逸出水体，提高了对NH4+-N 的降解效率，但对其实际应用有待进一步探索。固定化技术能够解决实际脱氮工艺中菌体流失、脱氮稳定性差等问题[4]，目前对于异养硝化-好氧反硝化菌的固定化已有一定的研究基础，使用过的材料包括活性炭、纳米Fe3O4、聚乙烯醇等[5-6]，寻求高效、廉价、耐用且无二次污染的菌株固定化载体成为进一步推进该菌应用研究的关键。硅藻土是一类廉价好用的吸附剂，其表面具有大量的、有序排列的微孔，从而具有很大的比表面积[7]，将其作为生物载体应用于废水处理中，由于硅藻土本身可以吸附污染物，因此可以达到强化生化反应的效果，极具应用价值[8]。本实验采用经适当改性后的硅藻土负载异养硝化-好氧反硝化菌，优化固定化条件的同时考察不同环境因素对固定化菌脱氮性能的影响，之后将该固定化菌投入到反应器中处理生活污水，研究其脱氮效果及稳定性。

1 材料方法

1.1 材料

（1）实验菌种 H1（实验室自筛），经测定该菌种具有异养硝化和好氧反硝化性能，经菌株鉴定为假单胞菌[9]。

（2）H1 生长培养基 KNO3，0.6g/L；KH2PO4，1.0g/L；MgSO4·7H2O，1.0g/L；琥珀酸钠，2.4g/L；pH7.0。

（3）NH4+模拟废水 (NH4)2SO4，0.35g/L；KH2PO4，0.75g/L；K2HPO4·3H2O，2.216g/L；MgSO4·7H2O，0.025g/L；柠檬酸三钠，1.81g/L；pH7.0。

（4）生活废水 取自吉林市长春路旁居民楼生活废水。其中总氮含量为70～75mg/L；COD 含量为470～481mg/L；氨氮含量为41～46mg/L。

1.2 方法

1.2.1 分析检测项目及方法

参照《水和废水监测分析方法》[10]，其中：总氮（TN），过氧化钾氧化-紫外分光光度法；氨氮 （NH4+-N），纳氏试剂分光光度法；硝态氮（NO3--N），紫外分光光度法；亚硝态氮（NO2--N），N-(1-萘基)-乙二胺光度法；COD，重铬酸钾法；菌悬液中微生物数量，稀释平板计数法。

1.2.2 H1 的固定化

（1）硅藻土的改性[11-12]①取50g 硅藻土在200℃下干燥4h，冷却至室温后按2.5∶1 的液固比称取硅藻土和水，搅拌均匀后加入浓度为40%硫酸，水浴温度100℃条件下充分搅拌4h，过滤后用除盐水洗涤至中性，105℃下烘干；②向其中加入一定浓度的碳酸钠溶液，边搅拌边滴加饱和氯化钙溶液，反应结束后真空抽滤；③将干燥后的硅藻土与FeSO4按一定的质量配比加入除盐水中，30℃下以150r/min 的速度搅拌2h，过滤，干燥2h 即得到改性硅藻土。

（2）菌株H1 的负载 取经摇床培养24h 的菌悬液300mL，3000r/min 离心20min，PBS 缓冲液洗涤3 次后，使用无菌水稀释至50mL，根据不同实验要求加入改性硅藻土，改变实验条件，在恒温水浴摇床中120r/min 振荡进行吸附实验，溶解氧（dissolved oxygen，DO）控制在5.0mg/L，待硅藻土颗粒沉降完全后吸取上清液并稀释，接种到平板恒温培养，48h 后对平板上的菌落计数为C1，初始菌悬液菌落计数为C0，根据公式Q1= (C0-C1)/C0× 100%，计算出菌体固定化率。

1.2.3 环境因素对固定化H1 脱氮效果的影响

抗环境干扰能力是衡量固定化菌脱氮性能的重要指标，因此本实验研究比较了DO 浓度分别为1.4mg/L、5.1mg/L、6.8mg/L；温度分别为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，pH 值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 条件下，游离菌及固定化H1 在反应器中对NH4+模拟废水的处理效果，24h 后检测水中NH4+-N、NO3--N、NO2--N 及COD 的变化。

1.2.4 实验装置

本实验装置如图1 所示，由好氧区、固液分离区组成。好氧区容积为5.0L，固液分离区容积为0.7L，好氧区投加改性硅藻土固定化菌，在底部一侧布置曝气头，DO 控制在6mg/L，温度控制在 25℃。

图1 实验装置图

1.2.5 改性硅藻土固定化H1 连续式处理生活污水

调节蠕动泵，控制进水流速为2mL/min，连续对废水进行14 天的处理，共处理40L 污水，一次性投加10g 负载H1 的硅藻土，每隔24h 将分离室中沉降的硅藻土回流到反应室中，DO 控制在6.0mg/L 左右，每隔24h 监测水中TN、NH4+-N、NO2--N 及COD 的变化。

2 结果与讨论

2.1 改性硅藻土固定化H1 效能的研究

2.1.1 吸附时间（t）及硅藻土用量对H1 固定化效果的影响

m(FeSO4)/m(硅藻土)=5.0%、温度为 30℃、pH=7.0 时，采用1.2.2 节方法考察时间及硅藻土用量对H1 固定化效果的影响。实验结果见图2。

从图2(a)可以看出，随着时间的增加，硅藻土对菌株的固定化率呈先上升后下降的趋势，在初始时间里，吸附过程较快，孔道效应明显；在18h 后，吸附效率下降；又经6h，硅藻土对于菌株H1 的吸附已达到饱和状态，固定化率达到最大为68.16%；如果增加时间超过30h，固定化率反而下降，这可能是由于环境中营养物质匮乏，菌株无法进行生长增殖，菌与菌之间的黏结力下降，在摇床振荡条件下H1 逐渐从硅藻土表面脱落，因此选定固定化时间为24h。从图2(b)可以看出，硅藻土用量的增加提供了更多的吸附孔道和比表面积，因而吸附量也随之增加，在菌悬液浓度一定条件下，当投加量为0.06g/mL 时，固定化率达到63.84%；当投加量继续增加时，固定化率下降到45.16%，这可能是由于在本实验所设的吸附条件下，继续增加硅藻土投加量反而会降低其悬浮效果，使部分硅藻土处于沉降状态，降低与菌体的接触效率，因此选定改性硅藻土用量为0.06g/mL。

图2 改性硅藻土固定化H1 条件优化

使用改性硅藻土对H1 进行固定化时，由于硅藻土本身物化特性及菌体代谢活性都会受到环境条件的影响，除pH 值及温度外，在本实验中，硅藻土改性时使用的FeSO4剂量也会影响菌体活性，因此本研究结合菌体固定化率及固定化菌的脱氮性能，考察分析了Fe2+加入量、pH 值、温度及DO 对固定化H1 效能的影响。

2.1.2 FeSO4剂量对固定化菌H1 效能的影响

温度为30℃、投加量为0.06g/mL、固定化时间为24h、pH=7.0、DO=5.0mg/L、硅藻土质量一定时，设置FeSO4占硅藻土质量分数分别为10.0%、7.0%、5.0%、3.0%、2.5%、2.0%、0，考察不同用量FeSO4的条件下，改性硅藻土颗粒对H1 固定化及生化活性的影响。实验结果见表1。

表1 的结果显示，加入FeSO4能够明显改善固定化率，当m(FeSO4)/m(硅藻土)=0 时，即不添加FeSO4进行改性，固定化率仅为 38.02%；而m(FeSO4)/m(硅藻土)=2.5%时，H1 负载率提升到60.91%，这是由于加入的Fe2+取代了硅藻土表面的硅羟基，使得硅藻土表面带有正电荷，这样提升了对菌体的吸附性。当m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%时，在上述实验条件下，固定化率基本保持恒定，为59.75%，但固定化菌对NH4+-N 的去除率达到最高，为61.62%，表明此时固定化H1 活性更强。据之前报道，金属离子能够通过共价作用来激活酶的催化能力，适量的Fe2+会对菌株异养硝化过程有一定激活作用，通过激发异养硝化过程中关键的溶解性单体周质酶及羟胺氧化酶的活性来提高脱氮效果[3]，可见经改性后的硅藻土对菌株的吸附效果不仅增强，同时强化了菌株的脱氮性能。此外，随着m(FeSO4)/m(硅藻土)增加到5.0%，固定化率也上升到62.10%，但固定化H1 对NH4+-N、CODCr的降解率出现明显下降，虽然Fe2+的加入提高了硅藻土对菌株的吸附效果，但过量的Fe2+可能会对H1 的活性造成一定影响[13]。根据以上实验结果，选定硅藻土改性过程中，m(FeSO4)/m(硅藻土)的最佳比例为3.5%。

2.1.3 pH 值对固定化菌H1 效能的影响

m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%、温度为30℃、改性硅藻土投加量为0.06g/mL、固定化时间为24h，设置pH 值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。图2(c)为不同pH 值对H1 固定化率的影响；图3 为不同pH 值对固定化H1 脱氮性能的影响。

从图2(c)及图3(a)可以看出，pH=5.0 时，固定化率仅为40.66%，固定化菌对NH4+-N 去除率也维持在较低水平，在偏酸条件下，由于硅羟基等活性基团从硅藻土表面解离出来变得更加困难[14]，因而可能抑制了其对菌体的吸附，此时游离菌COD 降解率仅为70.30%，表明H1 在酸性条件下新陈代谢能力下降，不利于菌体表面活性官能团在改性硅藻土表面微孔中的附着。由图3(b)看出，投加固定化菌的废水中 NO3--N 含量高达 0.68mg/L，表明NO3--N 的还原受到抑制，这可能是由于在酸性条件下，微生物对营养物质的吸收及体内的反硝化酶活性都相应受到影响[15]。固定化过程改变了细胞的生长环境，载体对于固定于其中的微生物细胞起到了缓冲作用，因而在酸性条件下固定化H1 较游离态H1 效能有所提高，对NH4+-N 去除率达到65.30%。当pH 值处于中性或弱碱性条件时，固定化率上升到65.97%，较pH=6 时对菌体的固定化率提高15%，固定化菌NH4+-N 降解率达到69.28%。

表1 不同m(FeSO4)/m(硅藻土)比例下H1 的固定化效果

图3 不同pH 值下固定化H1 脱氮性能测定

2.1.4 温度（T）对固定化菌H1 效能的影响

m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%、改性硅藻土投加量为0.06g/mL、pH=7.5、固定化时间为24h 条件下，分别设定温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，实验结果见图2(d)、图4。

图4 不同温度下固定化H1 脱氮性能测定

结合图2(d)、图4(a)，在低温环境下，外界温度为10℃时，固定化率仅为50%，由于菌体代谢速率下降，导致对NH4+-N 降解率较低，仅为51%左右。从图4(b)看出，NO3--N、NO2--N 出现积累，表明参与硝化及反硝化过程的各种酶活性都受到了不同程度的抑制，但相比之下固定化菌对NH4+-N的降解率较游离菌略有提升，为55.36%，表明载体在低温条件下对菌体起到了一定保护作用，降低了低温环境对菌体株的影响。随着温度升高，硅藻土表面硅羟基及H1 逐渐变得活跃，吸附效果也逐渐增强，在温度接近30℃时，硅藻土对H1 的吸附趋于平衡阶段，但当温度高于40℃时，图4(a)、图4(b)结果表明，NH4+-N 去除率出现明显下降，同时NO2--N 含量有积累的趋势，而NO3--N 并无明显上升，说明相比于硝酸盐还原酶，亚硝酸盐还原酶对于高温更加敏感[16]，而投加固定化菌的废水中NO2--N 积累量更少，表明固定化菌较游离菌对高温的耐受性增强，脱氮更彻底。

2.1.5 DO 对固定化H1 效能的影响

根据Wehrfritz 等[17]提出的异养硝化-好氧反硝化偶联机制，O2在异养硝化过程中伴随着氨单加氧酶（AMO）和羟胺氧化酶（HAO）参与反应，同时在好氧反硝化过程中参与协同呼吸，是整个脱氮过程中必要的底物，因此是影响异养硝化-好氧反硝化菌脱氮效果的主要因素。至今发现的不同菌株对DO 敏感性也不尽相同，但针对DO 对于固定化菌的影响鲜有报道。本实验通过调节曝气泵的强度控制DO 分别为1.4mg/L、5.1mg/L 和6.8mg/L，采用1.2.4 节方法比较DO 对于固定化H1 及游离菌脱氮过程的影响。

从图5(a)可以看出，随着DO 浓度的升高，游离菌及固定化菌对NH4+-N 及COD 的去除率明显增加，但图5(b)表明，NO3--N、NO2--N 也随之有较多积累，当DO 从5.1mg/L 升高到6.8mg/L 时，游离菌及固定化菌NH4+-N 去除率分别增加22.08%和30.96%。根据之前报道，高浓度的DO 利于提高氨单加氧酶及羟胺氧化酶活性，但有可能改变了脱氮途径，使得羟胺从可直接转换为N2O 转变为需经反硝化过程（NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→N2O→N2）去除[18]。当DO=6.8mg/L，固定化菌的NH4+-N 去除率可达69.01%，略高于游离菌，而NO3--N 及 NO2--N 含量分别为 2.05mg/L 和0.51mg/L，都远低于游离菌，因为硅藻土依靠吸附作用将菌株固定于其内部和表面，菌体对于氧的消耗由外至内形成了DO 梯度，内部的缺氧或微氧区缓解了氧气对于亚硝酸盐还原酶的抑制，使得脱氮过程得以顺利进行，因此，硅藻土固定化H1 对于高浓度DO 有更强的耐受性，脱氮效率更高。

图5 不同DO 条件下固定化H1 脱氮性能测定

2.2 硅藻土固定化H1 在反应器中连续处理生活 污水

处理结果如图6 所示。从图6 中可以看出，反应器启动时间为5 天，在启动期间，TN、NH4+-N、COD 去除率快速上升，NO2--N 含量波动较大；8天后，TN、NH4+-N去除率分别达到52.40%、55.64%，TN 去除率与NH4+-N 去除率基本保持同步，COD去除率为61.23%；8 天之后反应器中氮碳污染物去除效果趋于稳定，NO2--N 浓度在0.02mg/L 上下波动，维持在较低水平。实验证明，利用硅藻土固定化异养硝化-好氧反硝化菌在一个反应器中对生活污水有较好的连续处理效果。

3 结 论

（1）通过改性硅藻土对异养硝化-好氧反硝化菌H1 固定化的研究，确定了最佳固定化条件：吸附时间为24h，载体投加量为0.06g/mL，温度为30℃，pH 值为7.5；同时发现当m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%时，固定化率及固定化后菌体活性较高，使用适量Fe2+改性后的硅藻土作为载体可强化菌株的异养硝化性能。

图6 硅藻土固定化H1 连续处理生活污水 TN、NH4+-N、NO2--N 浓度及COD 去除率

（2）通过比较游离菌和固定化菌对环境因子耐受性的研究，结果表明在低温和酸性条件下，载体对于H1 起到缓冲保护作用。相比于游离菌，当DO升高时，投加固定化菌的NH4+模拟废水中NO2--N积累量更少，脱氮效率更高，表明固定化菌对环境的耐受性更强。

（3）固定化菌在反应器中连续运行8 天之后氮碳污染物去除效果趋于稳定，并且没有NO2--N 的积累，表明硅藻土固定化H1 适用于对污水的连续处理。

[1] Pei Z C，Ji L，Qing X L，et al. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp. CPZ24[J]. Bioresource Technology，2012，116：266-271.

[2] Yang X P，Wang S M，Zhang D W，et al. Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying- denitrifying bacterium ， Bacillus subtilis A1[J]. Bioresource Technology，2011，102：854-862.

[3] 于大禹，张琳颖，高波. 异养硝化-好氧反硝化菌异养硝化性能的影响因素[J]. 化工进展，2012，31（12）：2797-2800.

[4] 汤丽娟. 固定化好氧反硝化菌脱氮技术应用进展[J]. 海峡科学，2010（9）：10-11.

[5] 乔楠，张静，张金榜，等. 纳米Fe3O4负载好氧反硝化菌脱氮除磷性能[J]. 化工进展，2009，28（11）：2058-2062.

[6] Xiao J J，Zhu C X，Sun D Y，et al. Removal of ammonium-N from ammonium-rich sewage using an immobilized Bacillus subtilis AYC bioreactor system[J]. Journal of Environmental Sciences，2011，23（8）：1279-1285.

[7] 蒋小红，喻文熙，曹达文，等. 改性硅藻土处理城市污水技术的可行性研究[J]. 环境科学与技术，2007，30（3）：76-78.

[8] 金伟，赵雅萍，徐祖信，等. 硅藻土复合生物反应器处理生活污水[J]. 同济大学学报，2005，33（12）：1626-1629.

[9] 于大禹，郭威，张金榜，等. 好氧反硝化菌的筛选及其脱氮除磷性质的研究[J]. 微生物学通报，2009，36（4）：598-603.

[10] 国家环境保护总局. 水和废水监测分析方法[M]. 第4 版. 北京：中国环境科学出版社，2002.

[11] 罗智文，袁东，耿安锋，等. 改性硅藻土提高氨氮废水处理效果研究[J]. 安徽农业科学，2010，38（29）：16410-16411.

[12] 蔡慧林，汪正军. 碳酸钙改性硅藻土的制备及其吸附性能研究[J]. 广州化工，2011，39（17）：43-46.

[13] 王文超.重金属冲击对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮性能的影响研究[D]. 成都：西南交通大学，2013.

[14] 沈岩柏，朱一民，魏德洲，等. 硅藻土对诺卡氏菌的吸附作用[J]. 东北大学学报，2005，26（2）：183-185.

[15] 王弘宇，马放，苏俊峰，等. 好氧反硝化菌株的鉴定及其反硝化特性研究[J]. 环境科学，2007，28（7）：1548-1552.

[16] Liu Y，Gan L，Chen Z L，et al. Removal of nitrate using Paracoccus sp. YF1 immobilized on bamboo carbon[J]. Journal of Hazardous Materials，2012，230：419-425.

[17] Wehrfritz J M，Reilly A，Spiro S，et al. Purification of hydroxylamine oxidase from Thiosphaera pantotropha：Identification of electron acceptors that couple heterotrophic nitrification to aerobic denitrification[J]. FBES Letters，1993，335（2）：246-250.

[18] Zhang J B，Wu P X，Hao B，et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001[J]. Bioresource Technology，2011，102：9866-9869.