喘舒片微生物限度检查方法的建立

任仲丽 刘 珍 沙玉林 曹鲁娜 郑兆显*

喘舒片收载于《中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂第三册》[1]，温肾纳气、化痰定喘，临床上多用于治疗慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿，尤其适用于喘息性气管炎，由升华硫、大黄粉、盐酸克仑特罗、黄芩提取物混匀制成。现代大量研究发现大黄及黄芩对细菌、霉菌和酵母菌都有一定的抑制作用[2-13]，因此对喘舒片进行微生物限度检查时必须首先消除样品本身的抑菌活性，才能保证检查方法的科学、有效，确保广大人民的用药安全。

本研究选取3 家药品生产企业生产的8 批喘舒片进行微生物限度检查方法适用性试验，建立喘舒片微生物限度检查方法，为该制剂质量控制提供依据。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 供试品来自3 家不同药企生产的8 批不同批次的喘舒片。

1.1.2 菌种均购自广东环凯微生物科技有限公司，经本实验室鉴定合格，所用菌悬液均为第4 代。

1.1.3 培养基与稀释液均购于北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.4 仪器电子天平、高压蒸汽灭菌器、生物安全柜、细菌浊度仪、精密恒温培养箱、霉菌培养箱。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备按《中华人民共和国药典》四部通则1105、1106 菌液制备的要求[14]进行制备。

1.2.2 供试液制备按《中华人民共和国药典》四部通则1105、1106 供试液制备要求[14]依次制备1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500 的供试液。

1.2.3 需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

1.2.3 .1 常规法用“1.2.2”项下1∶10 或1∶100的供试液，分别制备试验组、供试品对照组、菌液对照组，每组取1 ml 注入平皿中，平行作2 个平皿。

1.2.3 .2 增加培养基体积法（0.2 ml/皿）取“1.2.2”项下1∶10 的供试液0.2 ml 注入平皿中，平行作10个平皿，作为试验组、供试品对照组、菌液对照组。

1.2.3 .3 增加稀释液法试验组、供试品对照组、菌液对照组操作均同“1.2.3.1”项，但“1.2.3.1”项下的1∶10或1∶100的供试液需换成1∶20或1∶200，1∶50 或1∶500 的供试液。

1.2.3 .4 计算将“1.2.3.1”“1.2.3.2”和“1.2.3.3”项下的平皿按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1105 要求培养后，试验组、供试品对照组、菌液对照组测定的菌落数分别记为A、B、C，按如下公式进行计算回收比：回收比R=（A-B）/C。

1.2.4 控制菌检查方法适用性试验

1.2.4 .1 耐胆盐革兰阴性菌检查方法适用性试验按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1106，进行供试品的制备和预培养，分别制备供试品组、阴性对照组、阳性验证组，混匀，33 ℃培养48 h。然后划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，33 ℃培养48 h[10]。若检不出，则增加肠道菌增菌液体培养基体积，重复试验。

1.2.4 .2 大肠埃希菌检查方法适用性试验按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1106，分别制备供试品组、阴性对照组、阳性验证组，混匀，33 ℃培养48 h，麦康凯液体及麦康凯琼脂培养基增菌培养[10]。若检不出，则增加胰酪大豆胨液体培养基体积，重复试验。

1.2.4 .3 沙门菌检查方法适用性试验按《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1106，分别制备供试品组、阴性对照组、阳性验证组，混匀，33 ℃培养24 h，RV 沙门增菌液及木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基增菌培养[10]。若检不出，则增加胰酪大豆胨液体培养基体积，重复试验。

2 结果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果

按照“1.2.3.1”项下常规法进行方法适用性试验，结果见表1。只有个别批次的黑曲霉回收比勉强达到0.5，其他各批次各菌种的回收比均不在0.5～2.0。因此，进一步采用增加培养基体积法（0.2 ml/皿）和增加稀释液法进一步进行适用性试验。

表1 常规法适用性试验的回收比(n=3)

按照“1.2.3.2”项下增加培养基体积法（0.2 ml/皿）进行方法适用性试验，结果见表2。所有批次的喘舒片对5 株试验菌的回收比均在0.5～2 的范围内。

表2 增加培养基体积法适用性试验的回收比(n=3)

按照“1.2.3.3”项下增加稀释液法进行方法适用性试验，结果见表3。当需氧菌总数检查将供试品稀释至200 倍，霉菌和酵母菌总数检查将供试品稀释至20 倍时，供试品所有批次的喘舒片对5 株试验菌的回收比均在0.5～2 的范围内。但多个批次的金黄色葡萄球菌、白念珠菌的回收比勉强达到0.5，因此，进一步增加稀释液进行适用性试验。

当需氧菌总数检查用稀释至500 倍的供试液，霉菌和酵母菌总数检查用稀释至50 倍的供试液时，其计数方法适用性试验结果见表4，所有批次的喘舒片对5 株试验菌的回收比均在0.5～2 的范围内。

表4 增加稀释液法适用性试验的回收比(n=3)

2.2 控制菌检查方法适用性试验结果

按照“1.2.4”项下控制菌检查方法进行适用性试验，结果见表5，其中耐胆盐革兰阴性菌和大肠埃希菌检查试验中，供试品组和阴性对照组均未见菌落生长；阳性验证组大肠埃希菌生长良好。沙门菌检查试验中，1、3、8 批次喘舒片的阳性验证组、阴性对照组和供试品组均未见菌落生长，则增加胰酪大豆胨液体培养基体积，重复试验。

表5 控制菌检查方法适用性试验(n=3)

按照“1.2.4”项下，增加胰酪大豆胨液体培养基体积，进一步对1、3、8 批次喘舒片的沙门菌检查方法适用性试验结果见表6。胰酪大豆胨液体培养基体积为200 ml 时，供试品组和阴性对照组均未见菌落生长；阳性验证组乙型副伤寒沙门氏菌生长良好。

表6 沙门菌检查方法适用性试验(n=3)

3 讨论

由以上结果可以看出，喘舒片制剂可采用培养基稀释法（0.2 ml/皿）或增加稀释液法进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数；两种方法都能很好地去除药物的抑菌作用，但增加稀释液法能够降低检查成本且操作简单，笔者建议采用增加稀释液法；大肠埃希菌和耐胆盐革兰阴性菌检查可采用常规法进行；沙门菌检查时，胰酪大豆胨液体培养基需增加到200 ml。

比较分析结果发现：1）不同厂家的喘舒片制剂具有相似的抑菌活性，即对金黄色葡萄球菌、白念珠菌、枯草芽孢杆菌等细菌抑制作用相对较强，对铜绿假单胞菌和黑曲霉的抑制作用较弱。2）不同厂家的喘舒片制剂抑菌活性有细微差异。

经查阅文献发现，喘舒片中的4 种原药材中主要的抑菌成分为大黄和黄芩，且对各种菌的抑菌效果与本文的结果基本一致。如刘鼎阔等[3]、虞夏晖等[4]采用最小抑菌浓度测定、纸片扩散法等研究发现大黄对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌5 种菌的生长均具有抑制效果。徐令清等[5]、毕月等[6]、董波等[7]的研究发现大黄中的抑菌成分主要通过破坏菌体细胞膜和干扰DNA 的复制及转录，来抑制细菌生长、繁殖。

叶英剑等[9]通过加碱温浸法提取的黄芩甙对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌作用较强，对沙门氏杆菌抑菌作用相对较弱。王鑫等[10]通过牛津杯法、微量稀释法测定黄芩各提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，发现黄芩水提物的抑菌作用最强，水煎液次之，醇提液效果最差。崔巍[13]的研究发现黄芩苷同样通过增加细胞膜通透性，使细胞营养物质丧失来抑制金黄色葡萄球菌。

微生物限度检查过程受人、机、料、法、环等多种因素影响，工作繁重且重复劳动量大，且是药品质量控制的重要手段，客观反映了企业生产过程质量控制的好坏，也是药品质量评价的重要指标，因此，建立合理有效的微生物限度检查方法尤为重要。