中药白果毒性物质4’-O-甲基吡哆醇的高效液相色谱-紫外检测器检测技术

黄强燕 李 莉 顾峥嵘 徐晶星 钱怡云 韦 敏 刘旻虹*

白果为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥成熟种子。2020 版《中华人民共和国药典》记载，白果，甘、苦、涩，平，有毒，归肺、肾经。具有敛肺定喘，止带缩尿的功效，用于痰多喘咳，带下白浊，遗尿尿频等症状[1]。目前，白果资源大部分供食用，既在国内市场销售又出口他国，是药食同源之品，收载于国家卫生和计划生育委员会规定的药食两用中药品种目录中。《本草征要》云“确有小毒，生食及熟者多食，均易中毒，小儿尤当慎之[2]”。现代文献报道，过多食用白果，容易出现惊厥抽搐，甚至死亡，尤其是儿童更易中毒。中毒患者主要表现为中枢神经系统及胃肠道症状，偶有末梢神经功能障碍[3]。白果中毒没有特殊解毒剂，临床治疗白果中毒患者时，对于轻度中毒患者，多采用催吐方法，中、重度中毒患者需进行洗胃，并根据情况给予地塞米松、盐酸纳洛酮静脉滴注，适当补充能量合剂与维生素等进行综合治疗[4]。

2020 版《中华人民共和国药典》中明确提示“生食有毒”，但未见对其毒性成分的限量标准及相关检测方法。1985年，Wada 等[5]首次从白果中分离得到4’-O-甲基吡哆醇（MPN）或银杏毒素（ginkgotoxin），并证实其是导致白果急性中毒症状的主要毒性物质，之后在银杏叶中亦发现这一成分，并广泛存在于各类银杏叶制品中[6-7]。Leuendorf 等[8]从银杏中克隆了基因Gbpdx1，并证实这一基因参与了MPN 结构类似化合物的合成过程，这一基因在银杏的种子、叶片以及树干组织中均有表达，尤其在种子的表达最强，这可能是白果种子中MPN 含量较其他部位含量更高的原因之一。

随着科技的进步及人们对白果安全性的逐步重视，已有多种方法应用到了检测白果及其制品中的MPN 含量中。然而已建立的荧光检测、离子对色谱法、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）等检测方法，对检测条件的要求较高，推广应用受到了限制[9-13]。目前，仍然缺乏一种更加便捷准确的检测方法，对中药白果中吡哆醇类毒性成分MPN 进行检测，以此有效监管和保证白果及其制品的安全。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Thermo U3000 美国赛默飞世尔科技有限公司），电子天平（XP105DR，十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司），电子天平（XP504，万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司），超声波清洗器（KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司）。选定Inertil®ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）为分析色谱柱。

1.2 药品与试剂

白果（均购自市场）；4’-O-甲基吡哆醇（MPN）对照品（Sigma-Aldrich 公司，批号：89960-BCCD4482）；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertil®ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-10 mmol/L 甲酸铵水溶液（7∶93）；流速：1.0 ml/min；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液精密称取MPN 对照品适量，加甲醇溶解稀释成对照品贮备液（414.4 μg/ml）。

2.2.2 供试品溶液取样品粉末（过4 号筛）2.5 g，精密加入纯水20 ml，称定重量，浸泡30 min，超声提取30 min。用水补足减失的重量，取上清液以0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，精密吸取10 μl 注入高效液相色谱仪。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系的考察精密吸取“2.2.1”项下MPN对照品贮备液适量，稀释成系列对照品溶液。以进样浓度X（μg/ml）为横坐标，色谱峰面积Y 为纵坐标，绘制标准曲线。见表1。

表1 MPN 线性方程

2.3.2 系统适用性实验取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液按“2.1”项色谱条件进样测定，记录色谱。见图1。在该色谱条件下待测成分能达到基线分离（分离度＞1.5）；其他成分对测定无干扰。

图1 白果对照品及样品MPN 分析色谱

2.3.3 定量限与检测限取对照品溶液（浓度0.103 6 μg/ml），按上述色谱条件下分别进不同体积进行分析。以信噪比为10∶1 时相应浓度计算定量限，以信噪比为3∶1 时相应浓度计算检测限。MPN 定量限为0.166 μg/g，检测限为0.066 μg/g。

2.3.4 进样精密度取对照品溶液（浓度20.72 μg/ml），按上述色谱条件，连续进样6 次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果表明：其进样精密度为0.4%，进样精密度良好。

2.3.5 重复性取编号8 的白果，按上述供试品溶液的制备方法，平行制备6 份供试品溶液，各精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，测定峰面积，计算含量，结果重复性试验的RSD 为1.5%，方法的重复性良好。

2.3.6 稳定性取“2.3.5”重复性项下一份溶液，分别于0、1、2、4、6、8、10、12 h 进样10 μl，记录峰面积，计算 RSD 为1.9%，结果表明稳定性良好。

2.3.7 加样回收率精密吸取“2.2.1”项下对照品贮备液7 ml 加水稀释至500 ml，作为加标对照溶液。取白果熟粉（过4 号筛，MPN 含量104.852 μg/g）取约1.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入20 ml 加标对照溶液，称定重量，浸泡30 min，超声提取30 min。用水补足减失的重量，取上清液以0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。精密吸取供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，平均回收率为90.79%，均在80%～120%，平均RSD 为1.4%。

2.4 样品含量测定

取样品12 批，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。见表2。

表2 12 批次样品中MPN 测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

MPN 是白果中主要的吡哆醇类毒性成分，由于MPN 的亲水性较强，故其在色谱系统的保留较差。为此，通过在流动相中加入离子对试剂或利用三氟醋酐对MPN 进行衍生化以克服这一缺点。故本实验前期考察了流动相乙腈与10 mmol/L 甲酸铵水溶液，流动相流速（0.8 ml/min 和1.0 ml/min），柱温（15 ℃、25 ℃、35 ℃和40 ℃），发现色谱条件为1.0 ml/min乙腈-10 mmol/L 甲酸铵水溶液（7∶93），柱温30 ℃时，目标峰峰型较好，且均能达到较好的分离效果、纯度等要求。在此检测条件下，MPN 在220、256、328 nm 处有最大吸收，为获得更好的峰型及更准确的实验结果，本研究采用220 nm 作为含量测定的检测波长。不同品牌高效液相（Waters e2695、岛津LC-20A、Agilent1200）、不同品牌4.6×250 mm，5 μm的色谱柱（岛津的Inertil®ODS-SP 或AtlantisTMT3色谱柱）均能使目标峰达到较好的分离效果、纯度等要求。

3.2 前处理方法的考察

经查阅相关文献资料，MPN 亲水性较强，在供试品溶液制备过程前期，考察了不同的提取溶剂：水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、纯甲醇、95%乙醇超声处理30 min 后进样，实验结果表明以水为提取溶剂含量测定结果较高。同时考察了不同提取时间，如超声30 min、超声1 h、浸泡30 min 后超声30 min、浸泡45 min 后超声30 min，结果表明浸泡30 min 后超声30 min，可达到较为满意的提取效果。

另外实验过程中发现MPN的含量与药材粉碎的粗细程度密切相关，故分别采用了粉碎后不过筛网、过3 号筛网、过4 号筛网、过5 号筛网的样品进行制备供试品溶液，发现过4 号筛网的样品含量最高，且操作简便，最终确定了上述供试品溶液提取方法。