去纤维蛋白核苷酸的分离与活性的初步测定

李 鹏

去纤维蛋白核苷酸的分离与活性的初步测定

李 鹏

本实验以猪肺为原料制备分离去纤维蛋白核苷酸，采用定磷法测定其含量，并通过动物实验考察了它在体内、外的抗凝活性。

去纤维蛋白核苷酸；活性；作用

去纤维蛋白核苷酸是一种多聚脱氧核糖核酸盐。1981年被评定为Defibrotieie（简称DEF）。七十年代，意大利学者[1]Niada.R等发现DEF纤溶作用机理是DEF通过促进血管壁产生和释放组织纤溶酶原激活物（t-Pa）发挥效应。近年，Niada.R又发现其具有抗血栓作用。经过人们大量的研究工作发现了DEF除此之外还具有抗局部缺血、抗粥样硬化等作用。

1 材料与方法

1.1 材料猪肺。试剂：0.1M Nacl+柠檬酸钠0.05M混合液。氯仿：异戊醇（24：1 v/v）（沈阳试剂一厂）。分析纯KH2PO4（北京化工厂）。牛血清白蛋白（上海医学化验所）。定磷试剂、试剂甲、试剂乙（自行配制）。仪器：组织搅拌机、DS-1组织匀浆机、20PR-5冷冻离心机、紫外分光光度计等。动物：小白鼠18～20g、兔子。

1.2 制备方法[2]猪肺细胞核沉淀DNP沉淀水相(DNA钠盐)。①加适量混合液、捣碎、匀浆、离心、收集细胞核；②用1.71M Nacl提取DNP；③注入蒸馏水中，有沉淀、离心、收集DNP；④用1.71M Nacl溶解、离心加适量氯仿-异戊醇除蛋白；⑤离心、收集水相；⑥注入无水乙醇，脱水，干燥得白色固体。

1.3 含量测定方法[2-3]

1.3.1 定磷法

1.3.1.1 标准曲线制备①配制标准磷溶液：称取分析纯KH2PO40.2195g，加蒸馏水至50ml，稀释100倍，浓度为10ug/ml。②定磷试剂：3M H2SO4：H2O：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=1：2：1：1。③制作标准曲线：按照下表1取样及试剂补加水至1.0ml，各加定P试剂3ml，立即摇匀。

表1 定磷法取样标准

1.3.1.2 测定总磷量取消化后样品，如前法测Aλ660。

1.3.1.3 测定无机磷量取未消化样品，如前法测Aλ660。

1.3.1.4 核酸含量计算DNA中含磷量9.2%，根据磷量知DNA量。

1.3.2 Lowry法

1.3.2.1 标准曲线制备①配制标准蛋白溶液：精密称取牛血清白蛋白50mg，用水定容至100ml，终浓度为0.5mg/ml；②制作标准曲线：按照下表2加入试剂样品。加水至1.0ml，各加试剂甲5ml，室温；加试剂乙0.5ml，37℃水浴15’测Aλ550，作A-c图。

表2 测量Aλ550值的取样标准

1.3.2.2 测定未知样品方法同前

1.4 抗凝活性测定方法[4-5]

1.4.1 体外活性测定样品液为将DNA溶于3ml 0.05M NaOH+7ml生理盐水；对照液为3ml 0.05M NaOH+7ml生理盐水。取一白瓷板，用滴管各加1滴样品液和对照液，各做三份，晃动瓷板，使液体均匀涂于凹槽内，然后从兔耳打孔，让血流出，滴于瓷板。各凹槽内各加2滴兔血，记时。此后每隔20s用针头挑一次血。每隔1min，倾斜白瓷板，直至垂直白瓷板而血液不流出记时T2，比较空白液和对照液的结果，测定各批样品的凝血时间，并且用第二批样品配成各种浓度，进行实验，以求得具有抗凝活性的最低浓度。

1.4.2 体内测定法[6]取小白鼠12只分两组，用静脉注射，空白组注射生理盐水，对照组注射DNA钠水溶液各加0.2ml，一批为注射两只，一个为空白，一个为对照。用药10min后用放血法，每只小鼠取三份血样，一份为3滴，然后同体外法测凝血时间，对比空白和样品。

2 结果

2.1 各批DNA钠盐制品产量及收率见表3。

表3 各批次DNA钠盐制品产量及收率值

由于提纯方法逐渐成熟，样品颜色有改观；以后各次产量收率接近，平均收率为1%左右。

2.2 定磷标准曲线见表4。

表4 定磷法得出的标准曲线值

第一次回归方程r=0.985分析原因为定量不准确，经改正后得到第二次标准曲线，r=0.9999符合要求，故选择此方程作为定磷标准曲线。

2.3 以牛血清蛋白为基准物，Lowry法制备蛋白标准曲线见表5。

表5 Lowry法得出的蛋白标准值

两条标准曲线相比较，第一次得到的标准曲线的相关系数及纵截距更接近于原点，为标准曲线。

2.4 各批次制品百分含量测定值与测定结果见表6、7。

表6 各批次含量测定值

表7 各批次含量测定结果

第一批收率不高，总体纯度近70%，剩余部分含有少量糖类及脂类未分离。

2.5 体外活性测定见表8。

表8 体外活性测定值

从表中可以看出，DNA钠盐制品有明显的延长凝血时间的活性，其在血液中最低抗凝浓度近似为150ng/ml。

2.6 体内活性测定见表9。

表9 体内活性测定值

结果表明体内也具有抗凝活性。

3 结论

本实验采用材料为猪肺与以往采用的牛肺相比较，平均收率相近（1%），但猪肺提取的DNA钠盐总体纯度（70%）稍低于牛肺（80%）。尽管猪肺提取的去纤维核苷酸纯度偏低，在抗凝活性却较高，可见在制备去纤维核苷酸时，不仅要注意纯度，而且注意活性降低因素。本实验对于去纤维核苷酸的制备、含量测定等方面所做工作为其作为治疗心血管药物的研究积累了原始数据，并为进一步的制备纯化及药理模型实验开了头。由于提取方法的去纤维蛋白核苷酸要求具有生物活性，所以实验过程要尽量低温操作，使制备处于0～5℃。在活性测定中，由于白瓷板法测定凝血时间每次实验条件不可能完全相同（如温度、血液流出情况等），所以其完全凝固时间、空白值不相同，但考虑相对延长时间，仍能看出效应。

[1] 周泉生.去纤维蛋白多核苷酸[J].生命的化学,1988(05).

[2] 张龙翔.高级生物化学实验选编[M].北京：高等教育出版社, 1989：1.

[3] 蔡武城,袁厚积.生物物质常用化学分析方法[M].北京：科学出版社,1982.

[4] 中国人民共和国卫生部药典委员会.中国药典二部标准附录•肝素生物检定法[S].1995.

[5] 徐涛,王荣廷.临床检验基础[M].北京：人民卫生出版社,1986：150.

[6] 徐淑云.药理实验方法学[M].2版.北京：人民卫生出版社,2002：886-887.

R927.2

A

1673-5846（2013）01-0129-03

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