RT-PCR技术检测VFMRNA在妊娠期糖尿病中的应用

季泽叶

本研究对妊娠晚期的妊娠期糖尿病孕妇及糖耐量正常孕妇大网膜组织中VFmRNA表达变化进行检测，旨在为探索GDM病因及VF的分子学作用机制提供进一步研究的基础。

1 临床资料

1.1 一般资料

选择我院产科行产前检查并行剖宫产术终止妊娠的妊娠36～40周、单胎、初产妇共200例，合并有T1DM或T2DM、妊娠期高血压疾病、肝肾疾病、甲状腺疾病和多囊卵巢综合征者除外。孕妇均在孕24～28周行50 g葡萄糖负荷试验，服糖后1h血糖水平＞7.78mmol／L者为阳性，阳性者进一步行口服葡萄糖耐量试验，依据美国糖尿病学会GDM标准进行诊断。若OGTY各时间点的结果中两项或两项以上高于正常诊断值为GDM(GDM组90例)；50g葡萄糖负荷试验及 OGTI结果均正常者诊断为NGT(NGT组110例)。两组孕妇年龄、孕周等比较，差异均无统计学意义(P＜0.05)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及空腹血糖、空腹胰岛素、血脂水平测定：晨起抽取空腹肘静脉血 5ml，1h内分离血清，-80℃保存待测。血浆葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)水平。试剂盒及全自动生化分析仪由瑞士罗氏公司提供；化学发光免疫分析法测定空腹胰岛素(FINS)水平，试剂盒及全自动生化分析仪由美国DPC公司提供；酶法测定总胆固醇(Tc)及甘油三酯(TG)水平，试剂盒及全自动生化分析仪由宁波亚太生物技术有限公司提供。实验按说明书步骤进行。采用稳态模型(HOMA)计算IR指数(HOMA—IR)，计算方法为FBG×FINS／22.5。

1.2.2 半定量 RT—PCR技术检测大网膜 vFmRNA表达

采用TRIzol(美国MRC公司产品)提取总RNA。参照RT—PCR试剂盒(日本TaKaRa公司产品)进行逆转录反应.以肌动蛋白(13-actin)为内参照，预扩增片段为589bp。应用凝胶成像系统和分析软件进行半定量分析，用 VF与-actin的灰度值比值表示VFmRNA的相对表达水平。

1.3 统计学方法

所有变量在统计学分析前首先进行正态检验，对总体不符合正态分布的变量，采用非参数检验中的 Kruskal-wallisH检验进行组间均数比较；对总体符合正态分布的变量采用方差分析。采用Pearson进行相关分析。统计学分析所用软件包为SPSS12.0系统。

2 结果

2.1 两组孕妇大网膜组织VFmRNA的表达

GDM组大网膜组织 VFmRNA表达水平为 0.8±0.4，NGT组表达水平为 0.5±0.3，GDM 组vFmRNA表达水平高于NGT组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 大网膜组织 VFmRNA表达水平与各指标的相关性

大网膜组织中，VFmRNA的表达水平与孕前BMI呈正相关关系(r=0.32，P＜0.01)，而与其他各指标及HOMA—IR无明显相关性(P＞0.05)。

3 讨论

近年来的研究表明，脂肪组织不仅是机体储存能量的场所，还是功能活跃的内分泌器官，可分泌多种脂肪因子，如瘦素、脂联素、抵抗素等。目前认为，许多脂肪因子及多肽在肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病的发病中发挥关键作用。

VF是新近发现的一种脂肪因子，具有类胰岛素样作用。对VF进行基因测序结果显示，其cDNA片段编码与前B细胞集落促进因子(PBEF)相符合，其中以 2400bp的 mRNA含量最高。VF基因位点在BMI、高密度脂蛋白胆固醇、TG等 IR综合征相关表型的连锁基因区域内，故被认为是影响肥胖相关表型或糖、脂代谢的候选基因。同时，这个区域还有另一重要基因——磷酸肌醇 3激酶，它可通过胰岛素／胰岛素样生长因子信号传导旁路影响葡萄糖及脂肪代谢。PBEF主要在骨髓、肝脏、肌肉以及有活性的淋巴细胞中高表达。有研究发现，在 6～12周内迅速肥胖的他DM模型鼠在逐渐肥胖的过程中，内脏脂肪组织中VF mRNA表达水平升高，而皮下脂肪组织和肝脏中VF mRNA表达水平较低，认为VF主要在内脏脂肪组织中大量表达。

VFmRNA的表达受基因、激素、脂肪因子等多种因素的调节。Btittche等在对高加索人的研究中，鉴定出7个单核苷酸多态性(SNP)和1个插Ⅳ缺失，并对其中3个SNP在研究人群中进行了基因型鉴定，未发现任何 SNP或单体型与空腹血浆 VF水平或12DM相关，但研究者发现，皮下和(或)内脏脂肪组织 VFmRNA表达的比例与这 3个基因多态性均有关，并且其中 1个基因多态性在非糖尿病个体中与餐后2h血糖及FINS水平显著相关，故认为VF的基因变异可能在皮下和(或)内脏脂肪组织 mRNA的表达中发挥一定作用，但在肥胖或眩 DM 发牛中的作用可能较小。在体外培养的3B—Ll脂肪细胞中，地塞米松可以上调VF的表达一致。研究表明，罗格列酮等药物可增加内脏脂肪组织 VF等脂肪因子的表达，从而降低血糖水平。

流行病学及动物实验证明，内脏性肥胖是心血管疾病的高危因素。研究表明，随着血糖水平的升高，内脏及皮下脂肪释放的VF增加，血中VF水平上升，VFmRNA表达也增强。Berndt等研究发现，内脏脂肪组织VFmRNA的表达与BMI有明显相关性，皮下脂肪组织VFmRNA表达与BMI无相关性(P＞0.5)。内脏脂肪组织VFmRNA表达与FINS呈明显正相关关系，但调整BMI后则无相关性(P=0.7)。本研究结果显示，晚期妊娠妇女大网膜组织VFmRNA表达水平在GDM孕妇中明显升高，可能的原因有：①由于GDM孕妇体内靶组织对VF的敏感性下降，为代偿性降低血糖水平而使大网膜组织VFmRNA表达增加；②GDM 作为一种炎症状态，其血液和组织中肿瘤坏死因子仪及白细胞介素6(IL-6)水平升高，而这些炎症因子可上调 VF mRNA的表达。故我们认为，VF mRNA表达与GDM及肥胖密切相关，因而可将VF mRNA表达水平作为GDM发病的预测因素，此外，进一步的研究证明，VF是独立于胰岛素而起降糖作用的脂肪因子，这也符合Fukuhara等运用竞争性组化配位测定法发现VF与胰岛素受体的结合位点不同于胰岛素，是完全独立于胰岛素的作用途径的结果。

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