液相色谱-串联质谱法测定小龙虾中硝基呋喃类代谢物残留量的不确定度评定＊

吴祥庆，杨姝丽，吴明媛，黄鸾玉，谢宗升，蒙源，庞燕飞

（广西壮族自治区水产科学研究院，广西南宁 530021）

0 引言

测量不确定度是指表征合理地赋予被测量之值的分散性与测量结果相联系的参数［1］。《检验检测机构资质认定能力评价检验检测机构通用要求》（RB/T 214—2017）中要求检验检测机构应建立相应的数学模型，给出相应检测能力评定测量不确定度的案例［2］。

硝基呋喃类药物是一类广谱抗生素，广泛应用于水产养殖［3］。硝基呋喃类药物具有遗传毒性，有可能导致基因变异，我国已于2002年颁布禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。硝基呋喃类药物原型药在动物体内虽代谢迅速，但代谢物会与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物。一般判定动物源性食品中硝基呋喃类药物的残留状况都是以其硝基呋喃类代谢产物的含量作为检测依据，硝基呋喃类药物主要有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林，其对应的代谢物分别为3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、5-甲基-吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-2-内酰脲（AHD）和氨基脲（SEM）。

液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高、定性定量准确，成为目前硝基呋喃类代谢物主要的检测方法。陈茹等［4］、吕燕［5］、蒙丽琼等［6］、林功师［7］、郭丽娜等［8］、李绪鹏等［9］、邢丽红等［10］都对液相色谱-串联质谱法测定硝基呋喃类代谢物的不确定度进行评定，但在对内标物引入的不确定度的分量上，未充分考虑内标法的特点，即内标物引入不确定度来自内标添加量的重复性。本文根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）对《食品安全国家标准水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱-串联质谱法》（GB 31656.13—2021）测定小龙虾中硝基呋喃代谢物残留量的不确定度进行评定，分析不确定度的主要来源，保证检测结果准确可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

液相色谱-串联质谱联用仪（Xevo TQ-XS 型号，配有电喷雾ESI离子源，美国Waters公司生产）；电子天平（梅特勒-托利多XS205DU、常熟市双杰测试仪器厂生产的JJ200型号）；振荡培养箱（LRH-250-Z型号，韶关市宏泰医疗器械有限公司生产）；多管式旋涡混合器（美国Troemner 公司Talboys 子公司生产）；氮吹仪（TurboVap LV 型号，拜泰齐贸易上海有限公司生产）；冷冻离心机（Centrifuge 5804R 型号，德国艾本德公司生产）；超纯水系统（Milli-Q Gradient 型号，美国密理博公司生产）；单道移液器（德国BRAND 公司生产）。

1.2 试剂与材料

标准品AOZ、AMOZ、SEM·HCl 和AHD·HCl（Dr.Ehrenstorfer，纯度≥98%）；内标物AOZ-D4、AMOZD5、AHD-13C3、SEM·HCl-13C15N2（Dr.Ehrenstorfer，纯度≥98%）；盐酸（优级纯）、2-硝基苯甲醛（色谱纯）、二甲亚砜（色谱纯）、氢氧化钠（分析纯）、磷酸氢二钾（分析纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙酸铵（优级纯）、甲酸（色谱纯）；实验用水为超纯水。

1.3 标准溶液的配制

（1）标准贮备液：称取AOZ 10.0 mg±0.1 mg、AMOZ 10.0 mg±0.1 mg、AHD·HCl 13.2 mg±0.1 mg、SEM·HCl 14.9 mg±0.1 mg，分别用甲醇溶解并定容至100 mL 容量瓶中，浓度为100 mg/L。

（2）混合标准工作液：移取4 种标准贮备液各0.1 mL至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，浓度为0.1 μg/mL。

（3）内标贮备液：称取AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-13C15N2各1 mg，分别用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，浓度为100 mg/L。

（4）混合内标工作液：移取4 种内标物贮备液各0.01 mL 到100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，浓度为0.01 μg/mL。

（5）标准曲线：移取标准工作液10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL 于空离心管中，加入混合内标工作溶液0.5 mL，除不加样品外，其余步骤按样品前处理操作，曲线浓度为1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，待测。目标物峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，以硝基呋喃类代谢物的含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.4 样品前处理

称取样品2 g（精确到0.01 g）于50 mL 离心管中，加入0.5 mL 混合内标工作液和5 mL 盐酸溶液（0.3 mol/L），如果样品结块不易分散，可用玻璃棒将样品捣碎，加入150 μL 2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），37 ℃避光振荡16 h，使样品分散。

取出样品，避光冷却至室温。加入4～5 mL磷酸氢二钾-氢氧化钠溶液，调节pH 值至7.2 左右（用精密pH 试纸测试）。加入8 mL 乙酸乙酯，振荡10 min，4 000 r/min 离心5 min，取上清液至10 mL 的玻璃离心管中，40 ℃氮气吹干。加入1 mL 甲醇溶液（5%），漩涡混匀30 s。如果溶液混浊，可14 000 r/min 离心10 min。用一次性注射器将下层清液小心吸出，经0.2 μm 微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱-串联质谱测定用。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：C18 柱（100×2.1 mm，粒径1.9 μm）或其他性能相当的色谱柱；柱温：30 ℃；进样托盘温度：10 ℃；进样量：10 μL；流动相：甲醇，5 mmol/L 乙酸铵（含0.1%甲酸），流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件表

1.5.2 质谱条件

离子化模式：ESI 源，正离子模式；毛细管电压：3.00 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：500 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/Hr；碰撞气流量：0.15 mL/min；雾化气流量：7.00 Bar；扫描模式：选择反应监测（MRM）（具体参数见表2）。

表2 选择反应监测参数表

2 结果与分析

2.1 不确定度的数学模型

硝基呋喃类代谢物含量的计算公式为

其中：x为试样中硝基呋喃类代谢物的含量（μg/kg）；y为响应值（目标物面积与内标物峰面积的比值）；a为斜率；b为截距；m为样品质量（g）；V为样品定容体积（mL）。

2.2 不确定度的来源及计算结果

从测量过程和数学模型分析可知，测定硝基呋喃类代谢物的不确定度主要来自以下4 个方面：①校正过程的不确定度，包括标准物质引入的不确定度、称量标准物质产生的不确定度、标准工作液配制过程中量器移取和定容产生的不确定度、标准工作液配制过程中容量误差和重复性产生的不确定度、采用最小二乘法拟合标准工作曲线求得试样浓度过程中引入的不确定度；②样品质量的不确定度；③内标物加入量的不确定度；④样品前处理操作过程差异的不确定度。

2.2.1 校正过程的不确定度

2.2.1.1 标准物质引入的不确定度

根据证书给出标准物质纯度、扩展不确定度和包含因子，计算标准不确定度和相对标准不确定度（结果见表3）。

表3 标准物质引入的不确定度

2.2.1.2 称量标准物质产生的不确定度

表4 称量标准物质产生的不确定度

2.2.1.3 量器移取和定容产生的不确定度

表5 量器移取和定容产生的不确定度

2.2.1.4 容量误差和重复性产生的不确定度

表6 曲线各级别的合成相对标准的不确定度

2.2.1.5 曲线最小二乘法拟合引入的不确定度

以目标物峰面积与内标物峰面积比值yi为纵坐标，目标物质量浓度x为横坐标，AOZ、AMOZ、AHD、SEM 拟合曲线分别为yAOZ=0.171 74x+0.013 99、yAHD=0.130 06x+0.015 15、yAMDZ=0.265 92x+0.069 03、ySEM=0.336 16x-0.107 77。计算理论值ŷ=ax+b，曲线拟合理论值计算结果见表7。

表7 曲线拟合理论值计算

表8 曲线拟合引入的不确定度

2.2.2 样品质量引入的不确定度

2.2.3 内标物引入的不确定度

硝基呋喃类代谢物检测采用内标法定量，样品与曲线在加入等量内标物前处理，因此内标物纯度对结果无影响，不确定度来自添加内标物的重复性误差，即移取内标应用液的移液器的重复性。

2.2.4 样品前处理过程引入的不确定度

样品前处理步骤操作会产生不确定度，以7次添加水平为2.5 μg/kg 的加标回收率计算不确定度（结果见表9）。

表9 样品前处理过程引入的不确定度

2.3 合成标准不确定度

合成以上计算所得的不确定度，结果见表10。

表10 合成标准不确定度

2.4 检测结果

在95%置信区间内，测量结果的扩展不确定度包含因子k=2，U=k×urel×。最终检测结果表示为cAOZ=2.29 μg/kg，U=0.33，k=2；cAMOZ=2.41 μg/kg，U=0.27，k=2；cAHD=2.45 μg/kg，U=0.31，k=2；cSEM=2.37 μg/kg，U=0.27，k=2。

3 结论

本文实验采用《食品安全国家标准水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱—串联质谱法》测定小龙虾中硝基呋喃代谢物残留量的不确定度，分析不确定度的来源，通过建立相应数学模型，对测定结果的测量不确定度进行评估。结果表明曲线的配制、拟合过程是不确定度的最大来源。因此，实际操作过程中可以通过增加标准曲线测定次数、选择精度较高的玻璃量器和移液器及引入不确定度较小的稀释方式来降低不确定度，提高检测结果的准确性和可靠性。