四川省主要栽种桑树品种的桑叶药用活性成分含量评价

张钰瑶 李 灵 邢慧子 高 平 邓小宽 周鹏程 樊平原 陈海琼

(1四川大学生命科学学院,生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川成都 610065; 2四川通世达生物科技有限公司,资阳市天然产物研发重点实验室,四川资阳 641500)

桑树是桑科(Moraceae)桑属(MorusL.)植物,为深根系快速生长的落叶灌木或小乔木。作为蚕桑产业重要的组成部分,桑树支撑起了繁荣几千年的丝绸之路。我国不仅是蚕桑产业的重要起源中心,还是茧丝生产与出口大国,拥有非常丰富的桑树品种资源。而四川省作为国家“东桑西移”工程的重要实施地区之一,桑树种植面积居全国第2[1]。蚕桑产业作为四川省支柱产业,主要产品产量质量均在全国前2位[2]。但传统蚕桑产业结构单一,单纯依靠种桑养蚕缫丝织绸,整体效益低且资源浪费严重。近年来,国家倡导对桑树资源进行综合利用,其中桑树活性物质研究备受重视。

桑叶作为被广泛应用于中药领域的重要材料,含有多种药用活性成分,在医药和健康领域有着广泛的应用前景,如降血糖[3]、抗炎[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、抗肥胖[7]等。目前关于桑叶活性成分的研究多集中在提取精制工艺和药理活性上,未见针对四川省主要栽种桑树品种药用品质综合评价的研究。总黄酮、1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)作为桑叶的主要药效成分,常用作评价桑树资源药效品质。但不同桑树品种活性成分差异较大,给桑叶进一步开发利用带来了诸多不便。因此,本试验选取四川省主要栽种桑树品种的桑叶为材料,通过检测桑叶中的总黄酮、1-DNJ含量来分析不同桑树品种中活性物质的含量差异,筛选出活性成分含量高的品种,为桑叶的食用、药用开发提供参考,并为桑树的栽培和推广奠定基础,以满足桑树多元化开发需求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试桑叶 桑叶样品 26 份,资阳市乐至县经济科技信息化局提供,考虑到不同季节对桑叶中活性成分的影响,因此本次试验的样品采集时间均为 2021 年 11 月份。桑叶样品的编号见表1。

表1 四川省主要栽种的26份桑树品种

1.1.2 主要试剂 无水甲醇、乙腈、硼酸氯化钾、甘氨酸、冰醋酸、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝,均为分析纯,成都科龙化工试剂厂产品;乙腈,色谱纯,成都科龙化工试剂厂产品;芦丁、1-DNJ标准品,纯度99%,成都植标化纯生物技术有限公司产品;芴甲氧羰酰氯,色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 电热鼓风干燥箱(101-O)、粉碎机(DFT-200),均为上海阳光实验仪器有限公司产品;水浴锅(R2010),英峪仪器厂产品;电子天平(JF1004)、超声波清洗器(JP-020),均为余姚市金诺天平仪器有限公司产品;高效液相色谱仪,北京创新通恒科技有限公司产品;Sepax Sapphire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);UV8100型紫外可见分光光度计,北京莱博泰科技仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 桑叶中活性物质的提取 将采集好的 26份不同桑树品种的桑叶按不同种类放置于干燥箱中,经温度60 ℃,时间 3 h 烘干后,粉碎过12目筛,并装入自封袋中注明编号及名称。分别称取 1.0 g 不同桑树品种的桑叶粉于圆底烧瓶内,加入蒸馏水(pH=8,用碳酸盐缓冲液调节)30 mL,放置 1 h 后放入恒温水浴锅中调至 70 ℃,加热提取 60 min。取出后抽滤,并转入 25 mL 容量瓶,用蒸馏水定容,得到不同桑树品种的待测样品溶液。

1.2.2 标准曲线绘制 (1)芦丁标准曲线绘制。称取15 mg的芦丁标准品于50 mL容量瓶中,加入无水乙醇进行溶解、定容,即得到芦丁母液。分别量取1、2、3、4、5、6 mL芦丁母液于25 mL容量瓶内,补充蒸馏水至25 mL。采用Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法[8]测定总黄酮含量。根据所测结果以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线,其回归方程为y=10.616x-0.000 3,R2=0.999 6。(2) 1-DNJ标准曲线绘制。称取10 mg的1-DNJ标准品于50 mL容量瓶中,加入 50%甲醇溶液进行溶解、定容,即得到1-DNJ母液。分别量取1、2、3、4、5、6 mL 的1-DNJ母液于25 mL容量瓶中并定容。用FMOC-CL衍生法[9]衍生后采用高效液相色谱紫外检测法测定含量,色谱条件为流动相乙腈∶0.2% 冰醋酸(V∶V)梯度洗脱,0～15 min 25∶75～80∶20,15～30 min保持 80∶20,流速为 1.0 mL/min,检测波长256 nm。蚕桑副产品综合利用色谱条件包括流动相比例为乙腈∶0.2% 冰醋酸(V∶V)=25∶75,在15 min 后将比例调为 80∶20,流速为 1.0 mL/min,使用256 nm的紫外检测器进行检测。根据所测结果以峰面积为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线,得回归方程为y=1 569.8x+315.35,R2=0.998 3。

1.2.3 含量测定 (1)总黄酮含量测定。精密量取26份不同桑树品种的桑叶样品待测液1 mL,放入25 mL 容量瓶内并用蒸馏水定容,按上述方法测定吸光度,计算得到总黄酮含量。(2)1-DNJ含量测定。精密量取26份不同桑树品种的桑叶样品待测液1 mL,置于 25 mL 容量瓶并用蒸馏水定容,按上述方法测定色谱峰面积,计算得到1-DNJ含量。

1.3 数据处理与分析

用SPSS Statistics 27.0对数据进行方差分析、显著性分析和正态性分析。试验均重复3次,数据表示为平均值±标准差,并用小写英文字母表示显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同桑树品种的桑叶总黄酮含量

从表2 可以看出,26份不同桑树品种的桑叶之间总黄酮含量差距大,总黄酮含量分布在0.906%～6.619%之间,大多数品种之间均存在显著差异(P<0.05)。其中总含量最高的品种是川98-1(6.619%),其次是丰田14号(6.181%)、丰田2 号(4.599%)。含量最低的品种是新一之(0.906%),与含量最高的品种相比相差7倍多。如图1所示,对数据进行正态性分析(S-W检验),26份不同桑树品种的桑叶总黄酮含量分布不符合正态分布(P<0.05),大多数供试品种桑叶的总黄酮含量分布在2.00%～4.60%之间,占所测定样本数的76.92%。其中川98-1和丰田14号2个品种的总黄酮含量均超过了6.0%。

图1 26份不同桑树品种的桑叶总黄酮含量分布

表2 26份不同桑树品种的桑叶总黄酮含量 %

2.2 不同桑树品种的桑叶1-DNJ含量

从表3可以看出,26份不同桑树品种的桑叶1-DNJ含量差距较大,1-DNJ含量分布在0.039 5%～0.180 4%之间,大多数品种之间均存在显著差异(P<0.05)。其中含量最高的品种是荆桑(0.180 4%),其次是无核大十果桑(0.175 9%)、台湾长果桑(0.144 7%)。含量最低的品种是湘 7920(0.039 5%),与含量最高的品种相比相差4倍多。如图2所示,对数据进行正态性分析(S-W检验),26份不同桑树品种的桑叶1-DNJ含量分布不符合正态分布(P<0.05)。大多数供试品种桑叶的1-DNJ分布在0.04%～0.12%之间,占所测定样本数的84.62%。其中荆桑和无核大十果桑2个品种1-DNJ含量均超过了0.175 0%。

图2 26份不同桑树品种的桑叶1-DNJ含量分布

表3 26份不同桑树品种的桑叶1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量 %

3 小结与讨论

品种是影响桑叶活性成分含量的重要因素。张丽丽等[10]对11个桑树品种进行研究显示,不同桑树品种桑叶黄酮类与生物碱类活性成分差异较大。宋志姣等[11]对保山地区12个桑树品种活性成分进行测量评价,结果表明各品种间活性成分含量差异显著。本论文以总黄酮、1-DNJ为指标成分,对四川省主要栽种的26份桑树品种资源的桑叶活性成分含量进行了研究,结果显示各品种间总黄酮与1-DNJ的含量均存在明显种间差异,这与前人的研究结果一致。其中,供试品种桑叶的总黄酮含量分布在0.906%～6.619%之间,含量最高的品种是川98-1(6.619%),其次是丰田14号(6.181%)、丰田2号(4.599%),含量最低的是新一之(0.906%),含量最高品种与含量最低品种之间相差7倍以上。1-DNJ含量分布在0.039 5%～0.180 4%之间,含量最高的品种是荆桑(0.180 4%),其次是无核大十果桑(0.175 9%)、台湾长果桑(0.144 7%),含量最低的是湘7920(0.039 5%),含量最高品种与含量最低品种之间相差4倍以上。但荆桑作为野生桑,叶片产量少且叶质粗糙坚韧,不适合用于养蚕,经济价值低[12]。出于促进蚕桑产业多元化发展的目的,川98-1、丰田14号、无核大十果桑、台湾长果桑等更适合作为蚕区推广种植的品种。

优质的桑树品种是蚕桑产业高质量发展的保证,桑树资源多元化利用是促进蚕桑产业可持续发展的基础。本文通过筛选四川省部分优质桑树资源,为桑叶总黄酮、1-DNJ开发应用及品种选育提供了理论基础研究,并为四川省推广桑树栽培品种和其综合利用提供了技术支持。