二氯喹啉酸对稗草生长发育及生长素含量的影响

曾文杰，肖自勇，金晨钟，柏连阳，彭 琼

(1.湖南人文科技学院农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000；2.湖南省农业科学院农业生物技术研究所，湖南 长沙 410125)

稗草Echinochloa spp.隶属于禾本科稗属，全球已发现约15种稗草，我国报道有8种。稗草一直是全球农业生产中的十大恶性杂草之一，严重威胁作物的产量和品质，其中在我国仅水稻危害面积就达670万hm2，是中国水稻产区最主要的恶性杂草之一[1]。在过去的几十年间，为克服稗草对作物安全生产的危害，农田化学防治已成为全球现代农业生产的重要手段之一。然而，由于化学除草剂的过度依赖和长期衍变，杂草抗药性问题日益突出，倍受全球关注[2]。

二氯喹啉酸属于合成激素类除草剂，是控制水稻田稗草生长的优秀除草剂之一，尤其对高龄稗草有特效[3]。自1995年二氯喹啉酸在湖南省洞庭湖与东江湖流域直播稻区大面积推广应用以来，其使用年限达二十年以上。许多地区已经形成抗二氯喹啉酸的稗草种群，且部分地区抗性稗草对二氯喹啉酸的抗药性指数达 600倍以上[4]。抗性稗草种群在我国稻区的蔓延扩大，不仅直接影响水稻的产量与品质，而且间接传播水稻重要病虫害，严重威胁水稻安全生产与农田生态环境。

生长素(IAA)是最早发现的植物激素，主要在植物体中具有分生能力的茎尖、幼叶和根等组织器官中合成，在调节植物从胚胎发生到成熟的生长进程中起着决定性作用[5]。生长素信号转导途径中的GH3参与稗草对二氯喹啉酸产生抗药性的过程[6]。目前，稗草对二氯喹啉酸产生抗性的机理研究主要集中在两种假说。一种认为稗草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(EcACO)和1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(EcACS)活性下降，短时间内无法积累足够的乙烯和有毒物质氰化物[7—9]。在植株体内产生乙烯和氰化物的过程经过了生长素信号通路[10—12]；然而，生长素及其代谢途径中的相关基因在稗草对除草剂产生高抗性过程中的作用机制尚不清楚。另一种则认为稗草对二氯喹啉酸产生抗性与β-氰丙氨酸合成酶(β-CAS)活性增强有关，抗性稗草主要通过提高氰化物解毒酶β-CAS的活性，从而控制有毒氰化物产生[13]。

本课题组以筛选得到的遗传背景一致的二氯喹啉酸敏感型生物型(S)稗草及抗性生物型(R)稗草为材料进行研究，发现敏感型与抗性型稗草之间无论是在14C-二氯喹啉酸的吸收、运转、代谢水平上，还是乙烯代谢途径中EcACO、EcACS的基因表达水平，亦或是β-CAS酶活及其基因表达水平上均无显著差异(待发表)。本文通过外施二氯喹啉酸、生长素处理，研究稗草对二氯喹啉酸产生抗性过程中的生长发育及其生长素含量变化，明确外源生长素处理对敏感和抗性两种生物型稗草材料产生的生态适合度差异，为下一步充分利用稗草基因组数据解析抗药性产生的机理奠定基础，以期为稗草绿色防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为不同生物型稗草：二氯喹啉酸敏感型(S)、抗性型(R)，均采集于湖南省常德市鼎城区水稻田。抗性稗草对二氯喹啉酸GR50(抑制稗草干物质重50%所需药剂剂量)抗性倍数＞78。试剂为75%二氯喹啉酸(美国Nufarm公司)，IAA(Sigma，纯度大于98.0%)。

1.2 方法

选取饱满的稗草种子，用98%浓硫酸浸泡处理4 min后，充分清洗干净。然后将预处理后的稗草种子铺在0.7%琼脂板上，做好标记。待稗草种子发芽长至2～3 cm时定植于花盆(21.5×21.5×45.0 cm)，每盆移栽15株，培养基质为过筛稻田土∶营养土=2∶1(V/V)。

待稗草长至3叶期，利用3WP-2000型行走式喷雾塔TP6501E喷头进行药剂处理，每处理设3次重复。试验设计如下：①以800 g·hm-2(田间推荐剂量)二氯喹啉酸进行茎叶处理(Q)；②0.1 mmol·L-1IAA溶液喷施处理30 min后，再进行800 g·hm-2二氯喹啉酸的茎叶处理(Q+IAA)。以未进行药剂处理、正常生长的稗草材料为对照(CK)。于处理后24 h取样，测定植株高度(植株基部与最长叶片叶尖之间的距离)、单株重量。蛋白浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性采用南京建成生物工程研究所生产的测试盒测定。

生长素含量(IAA)测定采用高效液相色谱法(HPLC法)；生长素的提取参照Peng等[14]的方法，并进行改进。准确称量植物样品0.2000 g，液氮速冻后研磨成粉；加入1 mL 80%甲醇后充分混匀，于4 ℃冰箱中浸提过夜；次日12 000 g冷冻离心10 min，将上清液移至1.5 mL离心管中；残渣用0.8 mL 80%甲醇重复浸提2次，每次浸提4 h，离心后合并3次上清液，冷冻浓缩至干；200 µL 0.1 mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.8)复溶样品，超声波振荡至完全溶解；200 µL石油醚萃取，充分混匀，弃去上层醚相，保留下层水相，重复1次，至上层清澈无色为止；水相过自制的过滤柱，去除残渣，200 µL超纯水重复洗涤过滤柱2次；C18柱中先加入1.0 mL 100%甲醇，待流干后重复1次，而后加入300 µL超纯水，进行C18柱的预平衡；植物样本滤液经过预平衡后的C18柱，300 µL超纯水洗脱后，1.2 mL 80%甲醇洗脱并收集，冷冻浓缩至干，用于HPLC的分析。高效液相色谱法条件为：Waters C18分析柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)，RF-10AXL荧光检测器；流动相用35%甲醇和65%的0.1%甲酸溶液，流速1 mL·min-1，检测波长218 nm，柱温35 ℃；进样量20 μL，根据外标法定量。

数据作图采用Microsoft Excel 2010，用SPSS数据分析系统进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 二氯喹啉酸对稗草生长特性的影响

由表1可知，敏感型(S)和抗性型(R)稗草的植株高度及单株重量在苗期具有一定差异。在不施药情况下，R型植株高度及单株重量分别比S型高45.5%和28.1%。二氯喹啉酸单独处理24 h后，R型植株高度及单株重量分别比S型高54.6%和84.2%。二氯喹啉酸与IAA共同处理后，与S型相比，R型植株高度及单株重量分别提高68.3%和125%。

二氯喹啉酸和IAA处理24 h后，敏感型稗草(S)的植株高度及单株重量与对照无显著差异；抗性型稗草(R)的植株高度在二氯喹啉酸和IAA处理24 h后，与对照相比也无显著差异；二氯喹啉酸单独处理、二氯喹啉酸与IAA共同处理后，R型稗草单株重量都显著高于对照，分别比对照高70.7%和75.6%。

表1 二氯喹啉酸对稗草幼苗生长的影响Table 1 Effect of quinclorac on seeding growth of barnyardgrass

2.2 二氯喹啉酸对稗草蛋白浓度的影响

二氯喹啉酸处理下，S型和 R型稗草幼苗中蛋白浓度与对照差异不显著，蛋白浓度分别增加了24.8%和31.3%。在加入外源IAA的二氯喹啉酸处理下，与二氯喹啉酸单独处理相比，S型稗草的蛋白浓度显著降低了24.9%，R型稗草中的蛋白浓度无显著变化；与对照相比，S型和R型稗草中的蛋白浓度均无显著差异。在不施药、二氯喹啉酸单独处理、二氯喹啉酸与IAA共同处理的条件下，R型稗草蛋白浓度都比S型稗草高，分别高23.5%、29.8%和64.0%(图1)。

2.3 二氯喹啉酸对POD活性的影响

由图2所知，在两种不同施药处理下，S型和R型稗草体内POD活性与对照均无显著差异。二氯喹啉酸处理后，与对照相比，S型和R型稗草POD活性分别降低23.9%和25.0%；在二氯喹啉酸与IAA共同处理下，与对照相比，S型稗草POD活性提高8.2%，而R型稗草POD活性反而降低20.7%。

图1 二氯喹啉酸对稗草蛋白浓度的影响Fig. 1 Effect of quinclorac on protein concentration of barnyardgrass

图2 二氯喹啉酸对稗草POD活性的影响Fig. 2 Effect of quinclorac on POD activity of barnyardgrass

2.4 二氯喹啉酸对SOD活性的影响

两种生物型稗草SOD活性测定表明(图3)，R型稗草在两种二氯喹啉酸处理条件下与对照相比均无显著差异。S型稗草SOD活性在二氯喹啉酸单独处理24 h后比对照显著提高29.6%；在二氯喹啉酸与IAA共同处理后SOD活性仅增加3.5%，与对照无显著差异。与二氯喹啉酸单独处理相比，外施IAA的二氯喹啉酸处理下，S型稗草SOD活性降低20.2%，而R型稗草中SOD活性提高2.0%。

2.5 二氯喹啉酸对稗草生长素含量的影响

S型稗草体内生长素含量在两种施药处理下与对照相比均无显著变化，而R型稗草体内的生长素含量在各个处理之间变化显著(图 4)。与对照相比，二氯喹啉酸处理下，S型稗草中 IAA含量仅提高25.6%，而R型稗草中IAA含量显著增加3倍左右。与二氯喹啉酸单独处理相比，在二氯喹啉酸与IAA共同处理下，S型稗草的IAA含量降低40.5%，而R型稗草IAA含量显著提高109.1%。与对照相比，在二氯喹啉酸与IAA共同处理下，S型稗草的IAA含量降低25.3%，而R型稗草的IAA含量显著增加7倍左右。

图3 二氯喹啉酸对稗草SOD活性的影响Fig. 3 Effect of quinclorac on SOD activity of barnyardgrass

图4 二氯喹啉酸对稗草体内生长素的影响Fig. 4 Effect of quinclorac on auxin in barnyardgrass

3 讨论

二氯喹啉酸是防除稻田稗草的特效选择性除草剂。二氯喹啉酸处理后会抑制植物生长，导致植株幼嫩组织黄化，逐步失绿，最终死亡[11]。本研究的实验材料为课题组前期利用单株分蘖法筛选的遗传背景一致的不同生物型(S型和R型)稗草。材料均通过两代繁种、收种。在不施药情况下，抗性型稗草植株高度及单株重量在苗期均高于敏感型稗草(表1)。

目前，杂草抗药性机理的研究主要集中在非靶标位点抗性(non-target-site resistance, NTSR)和靶标位点抗性(target-site resistance, TSR)[15]。我们前期研究发现，敏感型与抗性型稗草在14C-二氯喹啉酸的吸收、运转、代谢水平上并无显著差异。因此，稗草抗二氯喹啉酸的主要原因可能是生长素代谢通路中某一靶标位点的突变。同时，本课题组在14C-二氯喹啉酸的代谢研究中发现，S型和R型稗草在处理后的较短时间内就能很快代谢二氯喹啉酸，且S型和R型稗草在代谢水平上无显著差异(待发表)。因此，本研究选择二氯喹啉酸处理24 h后进行取样及相关测定。无论是二氯喹啉酸单独处理，还是与IAA共同处理，R型稗草的单株重量与对照相比分别提高70.7%和73.2%，这是R型稗草对二氯喹啉酸具有高抗药性的生理基础。二氯喹啉酸处理后，S型稗草的植株高度及单株重量与对照相比并未显著降低，这说明800 g·hm-2二氯喹啉酸处理24 h并未对S型稗草的生长产生明显的抑制作用。相反，二氯喹啉酸单独处理及外施 IAA的二氯喹啉酸处理均能显著促进 R型稗草的平均鲜重。前期研究发现，0.1 mmol·L-1IAA溶液喷施处理并不影响3叶期稗草植株的生长发育(待发表)。与二氯喹啉酸单独处理相比，外施IAA的二氯喹啉酸处理下，S型和R型稗草的植株高度有所下降，可能是外源生长素IAA被植株吸收后影响植株体内的生长素信号通路，从而抑制稗草植株的生长。

可溶性蛋白的亲水胶体性质强，能明显增强细胞的持水力。可溶性蛋白质的增加可以束缚更多的水分，同时减小逆境对植物产生的危害[16]。植物体内可溶性蛋白是一种很好的渗透调节物质，其含量可以反映植物对非生物胁迫的耐受能力[17]。本研究表明，抗性生物型稗草的蛋白浓度高于敏感性生物型稗草(图1)，体现了R型稗草对非生物胁迫的高耐受能力。与二氯喹啉酸单独处理相比，加入外源生长素IAA的二氯喹啉酸处理后，S型和R型稗草的蛋白浓度均有所下降，S型稗草显著降低24.9%，R型稗草仅降低5.1%，说明加入外源IAA后，在二氯喹啉酸的影响下，S型稗草的蛋白质合成受到抑制，S型稗草植株承受了较大的逆境危害。

当遭受胁迫时，植物体内产生活性氧(ROS)从而影响植物生长发育，相应的植株体内也有一套活性氧清除系统来保护植物免受危害，POD和SOD是植物体内防御活性氧毒害的重要保护酶系[18—19]。本研究表明，在二氯喹啉酸单独处理及外加IAA的二氯喹啉酸处理下，S型与R型稗草植株中POD活性与对照相比均无显著差异(图2)，说明经过二氯喹啉酸处理后植株本身防御酶系统的POD未发挥主要的保护作用。与对照相比，R型稗草SOD活性变化较小，说明其清除自由基的能力较强；S型稗草中的SOD活性显著提高了29.6%(图3)，表明S型稗草受到的活性氧伤害大，因而提高了自身的SOD活性[20]，而在施入外源IAA后，S型稗草POD活性与对照和单独二氯喹啉酸处理相比升高了，说明IAA能够通过提高敏感性稗草POD活性来抵御胁迫；R型稗草SOD、POD活性与其他处理相比变化幅度较小，说明IAA对抗性稗草的SOD、POD活性影响较小。

生长素能够促进植株生长发育及细胞分裂，同时还能够提高植物抗逆境胁迫的能力[21]。植物在受到逆境胁迫时，其体内的激素含量会发生变化，生长素作为植物激素，必然与逆境胁迫有着联系[22]。本研究中，在不施药、二氯喹啉酸单独处理、二氯喹啉酸与IAA共同处理的条件下，S型稗草体内的生长素含量变化幅度较小。与对照相比，R型稗草在二氯喹啉酸单独处理下生长素显著增加3倍，在二氯喹啉酸与IAA共同处理下生长素显著增加7倍，说明IAA含量增加对高抗二氯喹啉酸稗草的生长具有一定的促进作用。