红果参果实多糖的提取及其单糖组分研究

时间：2024-07-06

李斌，李贵，陈功锡，李辉，梁俊鹏，陈雅

(1.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南吉首 416000；2.中国药科大学，江苏南京 210000；3.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000）

多糖为机体内重要的天然生物大分子，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖等生理功效[1—3]。这些生物活性与其化学结构密切相关，单糖组成是多糖一级结构研究的重要内容。目前多糖的单糖组成分析方法主要有气相色谱(GC)、薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)等[4]。

湘西苗族资源植物红果参，又名蜘蛛果、肉算盘等，学名长叶轮钟草Campnumoea lancifolia，系桔梗科金钱豹属多年生草本植物[5—6]。其味甘、微苦，性平，具益气补虚、祛瘀止血功效，主要用于气虚乏力、跌打损伤，民间则多用于治疗肺痨咳嗽、瘰疬、疝气等[7]。同时由于其有较高的观赏价值，很受当地人们喜爱。2011年陈功锡等[8]对红果参多糖含量有初步报道，陈莉华等[9]报道了红果参多糖能很好地清除羟基自由基和超氧阴离子自由基，其清除能力与多糖浓度呈正相关性，对油脂氧化有明显的抑制作用。本文拟采用超声波法[10—11]提取红果参中具有活性作用的多糖，通过水解-还原-衍生，结合GC-MS[12—14]测定其单糖组成，为合理开发红果参资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

红果参果实采自湖南吉首市植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室红果参试验基地，海拔247 m，为当地农户从附近山林采挖栽培的植株。

1.2 试剂和仪器

葡萄糖(PR)、重蒸苯酚、浓硫酸(GR)、乙醇、氯仿、正丁醇、盐酸(GR)、三氟乙酸、乙酸乙酯、异丙醇、冰乙酸、乙酸酐、吡啶、苯胺、二苯胺、丙酮、磷酸、D-葡萄糖(BR，天津市科米欧化学试剂有限公司)、麦芽糖(BR，上海国药集团)，阿拉伯糖(BR)、D-半乳糖(BR)、D-木糖(BR)、D-甘露糖(BR)、L(+)鼠李糖(BR)、D-果糖(BR)由国药集团化学试剂有限公司提供，其他未标明试剂均为分析纯。

GCMS-QP2010气质联用仪(岛津)；UV-2550紫外可见分光光度计(岛津)；HETOLL 1500 冷冻干燥机(捷克Heto)；J-26XP高速离心机(美国贝克曼)；DCTZ-2000多用途恒温超声波提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；AUY 120电子天平(岛津)；HH.Q-1电热恒温干燥箱(长沙医疗器械厂)；RE-52真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 试验方法

1.3.1 红果参多糖超声提取工艺根据红果参特性，采用“果实—干燥—粉碎—过筛—脱脂—超声波提取—过滤(离心)—浓缩—醇沉—冷冻干燥—红果参粗多糖”的基本提取流程，通过单因素实验与L9(33)正交试验，研究浸提时间、温度、提取功率对多糖提取率的影响(表1)。

表1 正交设计实验因素水平Table1 Experimental factors and levels of orthogonal design

1.3.2 红果参多糖含量测定以硫酸-苯酚法显色[15]，紫外可见分光光度法测定红果参样品多糖含量。

标准曲线制作：称取干燥至恒重的葡萄糖，配置成100 µg·mL-1标准使用液。分别移取0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL标准使用液置于10 mL刻度管中，补充蒸馏水至1.0 mL。分别加入苯酚试剂1.0 mL，摇匀，于冷水浴中缓缓加入3.0 mL硫酸，立刻摇匀。静置5 min后，置于沸水浴加热15 min，取出后立即以流水冷却至室温。在λ= 488 nm处以紫外可见分光光度计测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标，葡萄糖质量M为横坐标，建立标准曲线方程，计算曲线相关系数。

样品处理：取样品溶液1.0 mL，按照硫酸-苯酚法，加入苯酚试剂，摇匀，冷水浴中缓缓加入3.0 mL硫酸，立刻摇匀，静置5 min后，沸水浴15 min，冷却后于λ= 488 nm处测定吸光值A。多糖含量按公式计算：多糖得率= (样品中多糖质量/红果参样品质量)×100%。

1.3.3 红果参多糖的分离纯化将所得粗多糖溶于纯水中，分别以乙酸乙酯、Sevage试剂（三氯甲烷-正丁醇1: 5）混匀萃取5次，取水相加入10% H2O2，水浴15 min，再加入1.5%活性炭粉末，水浴10 min过滤，滤液浓缩，冷冻干燥，得多糖成品。

1.3.4 红果参多糖的水解及衍生水解：将10 mg多糖成品溶液加入0.5 mL 12 mol·L-1盐酸，纯氮封管，置于沸水浴中水解8 h，然后减压浓缩水解液至最小体积。

还原：取0.066 g NaBH4，加入水解液中，再向水解液中加入0.66 mL浓氨水，静置反应过夜；加入冰醋酸至无气泡产生，再减压馏干溶液，去除产生的硼酸，得淡黄色水解产物。

衍生：水解产物中加入吡啶、乙酸酐各2.0 mL，于80 ℃水浴处理2.0 h，将衍生后的溶液减压浓缩至干，加入1.0 mL蒸馏水，并用1.0 mL氯仿反复萃取三次，将三次萃取液合至刻度管中，氮吹至氯仿体积为0.5 mL，低温密封保存，即得GC-MS待测衍生溶液；同时以氯仿为对照，进行空白实验。

1.3.5 GC-MS分析条件色谱条件：毛细管色谱柱；进样口温度245 ℃；柱箱起始温度130 ℃，保留3 min，以15 ℃·min-1升温至210 ℃，保留2.0 min，再以10 ℃·min-1升温至270 ℃，保留4.0 min；载气为氦气，恒流0.94 mL·min-1，分流比 20:1。

质谱条件：EI电离电压70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度230 ℃，溶剂切除时间3.0 min，M/Z范围50～500。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准曲线的测定结果表明，当葡萄糖质量M在10～100 g范围时，其与吸光度A线性关系良好，线性回归方程为A= 0.0055M - 0.0053，相关系数R= 0.9995。稳定性实验显示，其在8 h内测定结果稳定。精密度实验误差范围在0.23%～5.66% (n=6)，回收率为96.35%～101.80%。

2.2 红果参多糖提取及其含量

超声波溶剂法提取红果参果实多糖，通过正交试验，初步确定最佳提取条件为提取温度30 ℃，提取时间50 min，提取功率100 W，其中影响提取效果的因素主次顺序为提取时间＞提取温度＞提取功率(表2)。根据该最佳提取条件，测定其总糖得率为45.80%。

表2 正交试验结果Table2 The results of orthogonal test

2.3 红果参多糖组分

红果参多糖GC-MS分析谱图显示有5个主峰(图1)，对5个主峰成分进一步分析，得到红果参多糖主要单糖组成及百分比分别是阿拉伯糖(5.00%)、木糖(9.65%)、甘露糖(11.55%)、果糖(30.20%)、半乳糖(33.85%)(图2)。另外，在10.7～11.0 min之间，还有未知峰组分(图1)，具体组分有待进一步研究。

图1 红果参多糖的GC-MS总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of polysaccharide component from Campnumoea lancifolia by GC-MS

图2 红果参多糖各单糖组分的质谱图Fig.2 MS chromatogram of polysaccharide composition from Campnumoea lancifolia

3 讨论

本研究采用正交试验设计考察影响红果参多糖提取的因素，得出红果参多糖最佳提取条件。结果表明，提取时间是影响提取效果的主要因素，提取温度次之，提取功率影响相对较小，说明各因素对红果参多糖提取的影响存在一定的差异。前人分别采用柱前衍生HPLC法和水解—衍生—TLC法[16—21]对不同材料中多糖的单糖组成进行了研究，发现虽然TLC法可定性分析单糖组成，但GC-MS法和HPLC法能更合理地反映单糖的组成及配比，且柱前衍生化联合GC-MS测定多糖的方法更简便有效。因此，本研究采用衍生GC-MS法测定红果参多糖的单糖组成。GC-MS实验表明，红果参多糖主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖和半乳糖组成，其百分比分别为 5.00%、9.65%、11.55%、30.20%和 33.85%；另外，图1中存在其他峰，可能是其他单糖分子结构衍生物。考虑到糖(特别是酮糖)衍生物制备过程中，糖结构容易发生异构化，同种单糖可能出现数个衍生物的色谱峰。因此，这些峰组分有待进一步研究确认。

[1] Niu J, Pi Z F, Yue H, Wang Y, Yu Q, Liu S Y.Effect of ginseng polysaccharide on the urinary excretion of type 2 diabetic rats studied by liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatograpy B, 2012, 907: 7—12.

[2] Paulsen B S.Biologically active polysaccharides as possible lead compounds[J].Phytochemistry Reviews, 2002(1): 379—387.

[3] Liu L, Jia J, Zeng G, Wang Y, Yu Q, Liu S Y, Zhao Y, Qi X S, He C Y, Guo W, Fan D M, Han G H, Li Z T.Studies on immunoregulatory and anti-tumor activities of a polysaccharide from Salvia miltiorrhiza Bunge[J].Carbohydrate Polymers,2013,92(1): 479—483.

[4] 韩威,姜瑞芝,陈英红,高阳,高其品.银耳多糖单糖组成分析的三种色谱方法比较[J].天然产物研究与开发, 2012,24:359—361.

[5] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第73卷第2分册)[M].北京: 科学出版社, 1983.

[6] 谷中村,陈功锡.湘西药用植物概览[M].西宁: 青海人民出版社, 2003: 264.

[7] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海: 科学技术出版社, 1999.

[8] 李贵,张永康,陈功锡,陈雅,张小凤,陈功锡,文赤夫.湘西民族药用植物红果参果实化学成分初步分析[C].昆明: 第十届全国药用植物及植物药学术研讨会, 2011.

[9] 陈莉华,龙进国,谭林艳,廖微.红果参多糖的提取纯化及抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发, 2013,25: 170—173.

[10] 李俊,黄锡山,张艳军,苏小建,何星存.超声波法提取罗汉果多糖的工艺研究[J].中药材, 2007,30(4): 475—477.

[11] 何概易南,雷林生,陈洁,余传林,任婧,陈娜娜.木蹄层孔菌免疫活性多糖超声提取工艺研究[J].中药材, 2011,34(8):1277—1280.

[12] 贺亮,殷宁.苦楝果多糖的分离纯化及组成分析[J].天然产物研究与开发, 2007,19(1): 35—38.

[13] 顾林,姜军.山药多糖的分离纯化及组成研究[J].食品科学, 2007,28(9): 158—161.

[14] 熊伟,陈芝兰,钟国辉,田发益,郑岚.西藏松茸多糖的提取及其单糖组成研究[J].化学与生物工程, 2009,26(8): 58—60.

[15] 张秀明,侯惠婵.四种枸杞子的鉴别及含量测定[J].中药材, 2007,30(3): 282—283.