桑葚醋发酵优化及提取物抗氧化能力分析

赵 鑫， 任朝琴*， 戴先芝*

桑葚醋发酵优化及提取物抗氧化能力分析

赵 鑫， 任朝琴*， 戴先芝*

（阿坝师范学院 资源与环境学院，四川 阿坝 623000）

采用铁氰化钾（K3Fe(CN)6）还原法，以正交实验结果分别确定发酵时间、酵母菌含量、醋酸菌含量、发酵温度对桑葚人工发酵阶段的影响；实验表明，桑葚酒精发酵过程中总抗氧化能力最优的条件为：蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，温度30℃；桑葚醋发酵过程中总抗氧化能力最优的条件为：酒精发酵时间为5 d，醋酸菌含量1%，温度32℃；分别采用水杨酸法和DPPH法测得桑葚醋提取物对（‧OH）自由基和DPPH自由基有很好的清除作用，其清除率分别可达92.63%、94.48%。实验分析发酵型桑葚醋抗氧化能力变化的可能原因，并为发酵型桑葚醋能够成为新型植物型提取天然抗氧化剂提供理论基础。

桑葚；发酵工艺；抗氧化能力；自由基

桑葚（），系桑科（）桑属（）桑树（L.）的干燥果穗[1]，使用价值很高，既可食用又可入药，味甜汁多，酸甜可口，被誉为“民间圣果”[2]。现代药理学研究表明，桑葚对人体有很好的补血、抗氧化、消除自由基等保健功效，因此，现阶段被广泛应用于人体造血干细胞的生长、分化等方面的研究。

研究发现，桑葚营养丰富，富含白藜芦醇、花青素、虾青素、维生素等多种营养成分[3]，既可以鲜食又可用作中药材，作为水果和保健品具有广泛的应用。但新鲜的桑葚果实运输困难、不易保存、上市时间短；在食用方面并不能得到广大消费者的喜欢，且桑葚成熟周期短，保存条件苛刻，上市周期短，且不方便运输也成为了限制桑葚鲜果进一步发展的重要影响因素，因此将桑葚开发加工成其他产品很有必要的。

孙佳勰等[4]以桑葚为实验原料，探究了相关物质在桑葚酒精发酵中的变化情况，分析了构成桑葚果酒的相关物质；孔燕等[5]以酵母菌株考察了对桑葚果酒感官品质的影响，确定了酿制桑葚果酒的较优酵母菌株；陈麒等[6]研究了酵母接种量对桑葚果酒中甲醇含量的影响；吕行等[7]通过单因素和正交实验研究了桑葚不同发酵阶段的抗氧化活性能力变化规律，通过乳酸发酵的方式能有效提高产物的总抗氧化能力；决登伟等[8]研究了在高压环境下分析了桑葚总酚、总黄酮和花色苷的变化情况，表明高压环境下桑葚的抗氧化成分会不断流失，进而影响其抗氧化能力；李柏榆等[9]通过正交实验比较了纯化前后的桑葚多酚含量，且纯化后的桑葚多酚抗氧化能力较强。

针对“桑葚醋发酵”、“桑葚醋提取物”的现有研究现状，本文归纳总结桑葚醋发酵过程的影响因素，通过单因素和正交水平实验分析了桑葚酒精发酵和醋酸发酵过程中的产物生成情况确定桑葚醋的最适发酵条件，对能影响桑葚醋总抗氧化能力的相关因素做重点研究，在最适发酵条件下分析其桑葚醋提取物的抗氧化能力变化情况，研究了桑葚醋提取物其对（‧OH）、DPPH自由基的清除能力，为桑葚醋提取物作为植物型抗氧化剂提供了一定的理论数据。

1 实验

1.1 材料

本实验采用的桑葚鲜果购置于汶川县水磨镇市场，经戴先芝副教授鉴定合格后低温保存处理。

实验用水为实验室自制一次性蒸馏水；实验试剂：磷酸二氢钠、硫酸亚铁、过氧化氢、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、蔗糖、水杨酸、70 %乙醇、DPPH自由基醇溶液、乙酸乙酯、冰醋酸、无水乙醇、95 %乙醇均为实验室购置的分析纯试剂。

酵母菌种为安琪葡萄酒酵母，购置于安琪酵母股份有限公司；醋酸菌种为醋酸菌，购置于济宁祥园生物科技。

1.2 实验仪器

UV-1800PC紫外可见光光度计（上海美谱达仪器有限公司），JJ324BC分析天平（常熟市双杰测试仪器厂），HH‧S11-2-S电热恒温水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司），R-1001-VN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3 实验方法

1.4 桑葚醋提取方法

实验发酵阶段结束后，将发酵得到的桑葚醋利用旋转蒸发仪进行浓缩处理，在恒温25℃的条件下，加入乙酸乙酯萃取进行萃取2次，萃取结束后加入无水乙醇进行离心处理，过滤上层清液，水浴加热得到桑葚醋提取物。

1.5 总抗氧化能力检测[10-12]

取1 mL桑葚醋提取物样品，加入2.5 mL pH＝7.5的磷酸盐溶液，2.5 mL K3Fe(CN)6溶液（1%），振荡混合均匀，水浴反应30 min；加入3.0 mL三氯乙酸溶液（10%），离心处理600 s；取离心完成的上层清液1.5 mL，加入3.5 mL蒸馏水，0.5 mL FeCl3（1%），震荡混合均匀。在吸光度为700 nm平行测定3次实验数据，样品溶液的吸光值越大，则表征待测液的还原力越强。

1.6 自由基清除能力测定

1.6.1（‧OH）自由基清除能力测定[13-15]

在1 mL中蒸馏水中加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL、9 mmol/L H2O2溶液2 mL、振荡混合均匀后静置600 s，加入9 mmol/L水杨酸溶液2 mL、振荡混合均匀后静置0.5 h，以蒸馏水为参比溶液，在510 nm下测定吸光度0。取1 mL不同体积梯度的样品为实验组，按照上述步骤，在510 nm条件下平行测定3次实验数据，然后按照式（1）计算样品对（‧OH）自由基的消除率1。

式中，0为空白对照液的吸光值，A为加入待测样品后的吸光值，A为不加入水杨酸时待测样品的吸光值。

1.6.2 DPPH自由基清除能力测定[16-18]

移取5 mL蒸馏水，加入 0.5 mmol /L DPPH自由基醇溶液5 mL，振荡混合均匀后避光0.5 h，以蒸馏水为参比溶液，在517 nm下测定吸光度0。取5 mL不同体积梯度的样品为实验组，按照上述步骤，在517 nm条件下平行测定3次实验数据，然后按照式（2）计算样品对DPPH自由基的消除率2。

式中，0为DPPH溶液与无水乙醇混合后测定的OD517值，A为DPPH溶液与稀释后样品反应测得OD517值，A为无水乙醇与稀释后样品混合反应后测得OD517值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1酒精发酵及正交试验

在酒精发酵过程中，实验设计了蔗糖加入量（10 g/100 mL、12 g/100 mL、14 g/100 mL、16 g/100 mL、18 g/100 mL）、酵母菌含量（1%、5%、10%、15%、20%）、发酵温度（20、23、26、29、32℃）三个单因素，并在单因素试验的基础上进行正交试验，考察桑葚酒精发酵过程中总抗氧化能力的变化情况。酒精发酵过程单因素实验结果见表1，正交试验因素与水平见表2。

表1 酒精发酵过程单因素实验结果

表2 酒精发酵L9(33)正交实验因素设计

2.1.2醋酸发酵及正交试验

在酒精发酵的基础上，进一步设计实验考虑酒精发酵时间（3、5、7、9、11 d）、醋酸菌含量（0.05%、1%、5%、7%、9%）、发酵温度（26、28、30、32、34℃）三个单因素，并在单因素试验的基础上进行正交试验，考察桑葚醋酸发酵过程中总抗氧化能力的变化情况。醋酸发酵过程单因素实验结果见表3，正交试验因素与水平见表4。

表3 醋酸发酵过程单因素实验结果

表4 醋酸发酵L9(33)正交实验因素设计表

2.2 正交实验结果

2.2.1酒精发酵

在单因素数据基础上，以正交水平实验考虑蔗糖加入量、酵母菌含量、发酵温度3水平对桑葚酒精发酵过程总抗氧化能力的影响，寻找最适的酒精发酵条件，其正交实验结果和显著性分析如表5、表6所示。

表5 酒精发酵L9(33)正交实验结果与分析

（续表5）

表6 酒精发酵过程正交试验的F值和显著性分析

实验结果以总抗氧化能力作为评价指标，以SPSS软件对实验数据进行分析处理，分析R值，可知三者影响其酒精发酵的顺序为A（蔗糖加入量）＞C（发酵温度）＞B（酵母菌含量），且条件为蔗糖含量 14 g/100 mL，酵母菌含量5%，温度30℃，可较好的进行后续的醋酸发酵过程。

2.2.2醋酸发酵

在单因素数据基础上，以正交水平实验考虑酒精发酵时间、醋酸菌含量、发酵温度3水平对桑葚醋酸发酵过程总抗氧化能力的影响，寻找最适的醋酸发酵条件，其正交实验结果和显著性分析如表7、8所示。

表7 醋酸发酵L9(33)正交实验结果与分析

表8 醋酸发酵过程正交试验的F值和显著性分析

实验结果以总抗氧化能力作为评价指标，以SPSS软件对实验数据进行分析处理，分析R值，可知三者影响其醋酸发酵的顺序为A（酒精发酵时间）＞B（醋酸菌含量）＞C（发酵温度），且条件为酒精发酵时间为5 d，醋酸菌含量1%，温度32℃，可较好的进行后续的桑葚醋提取物分析研究过程。

2.2.3验证性实验

在正交实验结果的基础上，对桑葚酒精发酵和醋酸发酵的总抗氧化能力进行平行试验验证，实验结果表明，酒精发酵A2B3C3和醋酸发酵A1B1C2组合都有较好的总抗氧化能力，其结果分别为54.45 mg/mL、77.61 mg/mL。从验证性实验结果可知，酒精发酵和醋酸发酵的相应实验组合对后续的自由基清除率实验是可靠有效的。

2.3 （·OH）自由基消除率测定结果

图1为桑葚醋提取物清除（‧OH）自由基的能力。由图1可以看出，桑葚醋提取物浓度在2～10 mg/mL范围时，清除能力随浓度的提高而增加；在10～12 mg/mL范围内时，清除能力随浓度的提高而减少，其提取物浓度达到10 mg/mL时，样品浓度的对（‧OH）自由基消除能力最强，为92.63%，从实验数据可知桑葚醋提取物对（‧OH）自由基具有很好的清除率，具有较好的抗氧化性能。

图1 桑葚醋提取物清除（‧OH）自由基的能力

图2 桑葚醋提取物清除DPPH自由基的能力

2.4 DPPH自由基消除率测定结果

由图2可以看出，桑葚醋提取物浓度在2～10 mg/mL范围时，清除能力随浓度的提高而增加；在10～12 mg/mL范围内时，清除能力随浓度的提高而减少，其提取物浓度达到10 mg/mL时，样品浓度的对DPPH自由基消除能力最强，为94.48%，从实验数据可知桑葚醋提取物对DPPH自由基具有很好的清除率，具有较好的抗氧化性能。

3 结论

实验以桑葚鲜果为原料，采用人工发酵的方法，根据单因素和正交水平实验，以SPSS软件对实验数据进行分析，得到桑葚酒精发酵最优因素为：蔗糖含量14 g/100 mL，酵母菌含量5%，温度30℃，在该实验基础上，进行桑葚醋酸发酵，可知在酒精发酵时间为5 d，醋酸菌含量1%，温度32℃是其发酵的最优因素。采用旋转蒸发仪获得桑葚果醋提取物，以紫外分光光度法测得桑葚醋提取物对（‧OH）自由基和DPPH自由基有较强的清除效果，其清除率分别可达92.63%、94.48%，同时通过（‧OH）自由基和DPPH的清除效率佐证了旋转蒸发仪是提取桑葚醋提取物的一种有效方法。

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Optimization of Mulberry Vinegar Fermentation and Analysis of Antioxidant Capacity of Extract

ZHAO Xin, REN Chao-qin*, DAI Xian-zhi*

（Institute of Resources and Environment, Aba Teacher University, Aba 623000, China）

In this article, potassium ferricyanide reduction method was used to determine the effects of fermentation time, yeast content, acetic acid bacteria content and fermentation temperature on artificial fermentation process of mulberry through the orthogonal experiment results. The experimental results show that the optimal conditions of total antioxidant capacity were sucrose content of 14 g/100 mL, yeast content of 5% and temperature of 30℃. The optimal conditions of total antioxidant capacity in acetic acid fermentation of mulberry were as follows: Alcohol fermentation time was 5 d, acetic acid bacteria content was 1%, temperature was 32℃; Salicylic acid method and DPPH method were used to determine the hydroxyl radical and DPPH radical scavenging activity of Fructose Fruccini Vinegar extract. The scavenging rates were 92.63% and 94.48%, respectively. The experiment analyzed the possible reasons for the change of antioxidant capacity of fermented mulberry vinegar, and provided a theoretical basis for the fermented mulberry vinegar to be a new type of natural antioxidant extracted from plants.

mulberry; fermentation process; antioxidant capacity; free radical

O656.6

A

1009-220X(2022)01-0057-08

10.16560/j.cnki.gzhx.20220108

2021-06-21

2019年四川省阿坝师范学院省级大学生创新创业训练计划项目（编号S201910646099）；2020年四川省阿坝师范学院国家级大学生创新创业训练计划项目（编号202010646027）。

赵鑫（1998～），男，汉族，四川资阳人，本科；主要从事化学研究。

通讯作者：任朝琴（1982～），女，藏族，四川小金人，副教授；主要从事民族药物学研究。

戴先芝（1983～），男，汉族，山东东平人，硕士，副教授；主要从事民族药物学研究。