保健品中添加化学降糖药物的检测分析

曹扬兰，林柏林，冯慧萍

(1 湖北省钟祥市人民医院骨科，湖北 钟祥 431900；2 广东药科大学药学院分析化学教研室，广东 广州 510006)

保健食品是适用于特定人群食用，能调节人体的机能，但不以治疗疾病为目的[1]，有些违法商家在保健食品中添加微量的化学合成药物，但在说明书上并没有标明所添加化学药成分的种类、剂量及不良作用，长期服用此类产品会引起严重的健康隐患[2]。

保健品中添加化学药的主要有降压药，降糖药，感冒药等。常见口服降糖药有磺酰脲类，二甲双胍类，α-葡萄糖苷酶抑制剂，胰岛素增敏剂，餐时血糖调节剂，醛糖还原酶抑制药等。目前保健品中添加的降糖药物主要是磺酰脲类和双胍类药物；这两类药物的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱二极管阵列紫外光谱及其光谱纯度鉴别法[3-5]和近红外光谱法[6]等，高效液相色谱-质谱联用法等[7-12]。舒宁胶囊是市售保健品，本文建立了薄层色谱和高效液相色谱法检测该保健品中添加的磺酰脲类和双胍类药物成分。

1 试剂和方法

1.1 试剂和仪器

GF254硅胶粉末，青岛海洋化工厂；羧甲基纤维素钠粉末，青岛海洋化工厂；舒宁胶囊(生产批号：080420)，乌鲁木齐康福源生物技术开发有限公司；格列苯脲对照品(批号：100135-200404)，中国药品生物制品检定所；盐酸二甲双胍标准对照品(批号：100664-200602)，中国药品生物制品检定所；氯仿，环己烷，乙醇，冰醋酸，碘化铋钾，色谱纯乙腈，德国默克公司；色谱纯甲醇，德国默克公司；乙酸，三水合乙酸钠，超纯水，正丁醇，铁氰化钠，亚硝基铁氰化钾，氢氧化钠。

5×15玻璃板，展开缸，紫外灯，远红外干燥器，恒温水浴锅，日本岛津高效液相色谱仪(LC-10ATvp溶剂输送泵、SPD-10Avp紫外检测器)。

1.2 格列苯脲和二甲双胍薄层色谱定性分析

(1)精密称取格列苯脲对照品1 mg和二甲双胍对照品 1 mg，分别置于1 mL容量瓶中，加入二氯甲烷溶解定容摇匀即得。

(2)取舒宁胶囊10粒内容物，研细，精密称取粉末1 g置50 mL具塞锥形瓶中，加水20 mL，超声30 min，过滤，滤液水浴蒸干，加入甲醇2 mL溶解过滤，滤液取滤液0.2 mL甲醇稀释至2 mL为二甲双胍定性检测的样品溶液1。药材滤渣加CH2Cl220 mL，超声30 min，过滤，滤液作为格列苯脲定性检测的样品溶液2。

(3)按照胶囊处方各取药材10 g加水500 mL超声30 min，取续滤液10 mL水浴蒸干，加入甲醇2 mL溶解过滤，取滤液0.2 mL甲醇稀释至2 mL为二甲双胍定性检测的阴性对照溶液1。药材滤渣加CH2Cl220 mL，超声30 min，过滤，滤液为格列苯脲定性检测的阴性对照溶液2。

1.3 格列苯脲和二甲双胍定量分析

1.3.1 高效液相色谱条件

格列苯脲 Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相乙腈：0.04 mol/L乙酸乙酸钠缓冲液=62∶38，流速1 mL/min，检测波长300 nm，进样量20 μL。

二甲双胍 Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相甲醇：0.05 mol/L磷酸二氢胺(含0.025%十二烷基磺酸钠)=50∶50，流速1 mL/min，检测波长230 nm，进样量20 μL。

1.3.2 标准溶液和样品的配制

1.3.2.1 格列苯脲标准品溶液

精密称量格列苯脲2 mg，于10 mL容量瓶中加入甲醇溶解至刻度，得储备液。准确量取储备液2～10 mL容量瓶中用格列苯脲定量分析项下流动相稀释至刻度，得格列苯脲对照品溶液。

1.3.2.2 二甲双胍对照品溶液

取二甲双胍对照品1 mg置于1 mL容量瓶中，加入二甲双胍定量分析项下流动相稀释至刻度，得二甲双胍对照品溶液。

1.3.2.3 样品溶液制备

取舒宁胶囊10粒，取内容物，研细，准确称取粉末1 g置50 mL具塞锥形瓶中，加水20 mL，超声30 min，过滤，滤液水浴蒸干，加入甲醇20 mL溶解，精密量取续滤液0.5～10 mL容量瓶中，加二甲双胍定量分析项下流动相定容混匀，再精密量取滤液1～25 mL容量瓶中，加流动相定容混匀，微孔滤膜过滤，制备样品溶液1。滤渣烘干，粉末加CH2Cl220.00 mL，超声30 min，过滤，滤液用格列苯脲高效液相色谱流动相稀释 5倍，微孔滤膜过滤得样品溶液2。

1.3.2.4 阴性对照溶液

取按照胶囊处方各取药材10 g加水500 mL超声30 min，过滤，滤液水浴蒸干，加入甲醇2 mL溶解，过滤，取滤液 0.5～10 mL容量瓶中，加二甲双胍定量分析项下流动相定容混匀，得阴性样品1。滤渣烘干加入CH2Cl2200 mL，超声 30 min过滤，取续滤液10 mL于水浴锅上蒸干，加入格列苯脲高效液相色谱流动相10 mL溶解微孔滤膜过滤，得阴性对照液2。

2 结果与讨论

2.1 格列苯脲薄层色谱定性分析

分别取阴性对照溶液2、样品溶液2及格列苯脲对照品溶液10 μL、格列吡嗪对照品溶液10 μL和格列齐特对照品溶液10 μL点于硅胶GF254板上，在展开剂氯仿∶环己烷∶乙醇∶冰醋酸=4∶12∶1∶1中展开40 min，取出薄层色谱板，晾干，置紫外灯下检测，格列苯脲对照品及样品在相同Rf值均呈暗紫色斑点(见图1a)，阴性对照溶液在相应位置无暗斑。薄层板喷显色剂碘化铋钾冰醋酸溶液显色，格列苯脲对照品及样品在相同Rf值均显橙红色斑点(见图2b)，阴性对照溶液在相应位置无斑点。常用磺酰脲类药物有格列苯脲、格列齐特、格列吡嗪和格列喹酮等，样品GF254薄层板紫外灯检测，有2个暗紫色斑点，但显色剂显色只有格列齐特的斑点。可见，舒宁胶囊中添加了格列苯脲成分。

图1 样品中格列苯脲FLC鉴别图

2.2 二甲双胍薄层色谱定性分析

分别取阴性对照品溶液1、样品溶液1及二甲双胍对照品10 μL、苯乙双胍对照品溶液10 μL点样于硅胶GF254薄层板，在展开剂正丁醇∶冰醋酸∶蒸馏水(5∶1∶1)中展开40 min，取出薄层色谱板，晾干，置紫外灯下检测，对照品及样品均显暗紫色斑点(见图2a)，阴性对照溶液无斑点。后喷显色剂10%NaOH：10%铁氰化钠：亚硝基铁氰化钾=1∶1∶1，对照品及样品均出现橙红色斑点(见图2b)，阴性对照溶液没有斑点。常用双胍类药物有二甲双胍和苯乙双胍，样品GF254薄层板紫外灯检测有3个暗紫色斑点，但显色剂显色只有二甲双胍的斑点。可见，舒宁胶囊中添加了二甲双胍成分。

图2 样品中二甲双胍薄层色谱鉴别图

2.3 格列苯脲和二甲双胍定量分析的方法学验证

2.3.1 专属性，精密度考察

取取1.3.2.1项下、1.3.2.3项下和1.3.2.4项下溶液稀释10倍，进样，分别得到格列苯脲对照品溶液色谱图(图3b)；样品溶液1色谱图(图3a)；阴性对照液1色谱图(图3c)。比较色谱图，tR=8.5 min时，格列苯脲对照品溶液和样品溶液有色谱峰，阴性对照溶液无。可见，此色谱条件专属性强。

图3 格列苯脲(a)对照品，样品溶液2(b)和阴性对照溶液2(c)的HPLC图

取1.3.2.2项下二甲双胍对照品溶液进样，得色谱图 (图4a)；取1.3.3.3项下样品溶液2进样，得色谱图(图4b)；取1.3.2.4项下阴性对照液2进样，得色谱图(图4c)。比较色谱图，样品溶液和二甲双胍对照品溶液在tR=4.8 min有色谱峰，但阴性对照溶液无，可见此色谱条件专属性强件专属性强。

图4 二甲双胍对照品(a),样品溶液2(b)和阴性对照品溶液2(c)的HPLC图

取上述对照品溶液连续进样6针，格列苯脲峰面积RSD值为1%；二甲双胍峰面积RSD为1.4%；均符合高效液相色谱法方法学精密度要求。

2.3.2 线性关系考察

(1)依照1.3.2项下方法，准确配制4.00，8.00，12.0，16.0，20.0，24.0，28.0，32.0，36.0，40.0 μg/mL格列苯脲标准溶液，分别进样，测定峰面积A，以A对C进行线性回归，格列苯脲线性方程为A=12558C+2793.6，r=0.9999。

(2)依照1.3.2项下方法，准确配制5.00，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0，40.0，45.0，50.0 μg/mL二甲双胍对照品溶液，分别进样，得到峰面积A，以A对C进行线性回归，二甲双胍线性方程为A=94325C+6015.4，r值为0.9999。

2.3.3 稳定性试验

取样品溶液稀释10倍，于0，2，4，6，8，10小时各进样1针，计算格列苯脲RSD值为1.3%；二甲双胍RSD为1.5%。均符合高效液相色谱法方法学稳定性要求。

2.3.4 重复性实验

依照取1.3.2.3项下方法制备样品溶液1和样品溶液2各6份，均稀释10倍，分别进样，样品中格列苯脲重复性结果RSD为1.1%；二甲双胍样品重复性结果RSD为1.3%。均符合高效液相色谱法重复性验证要求。

2.3.5 样品含量测定

取1.3.2.3项下制备样品溶液1和样品溶液2，分别进样，得平均峰面积，代入格列苯脲和二甲双胍标准曲线中，计算格列苯脲浓度为8.59 μg/mL，样品中添加的格列苯脲含量为1.80 mg/g。计算二甲双胍浓度为16.0 μg/mL，样品中添加二甲双胍含量为60.0 mg/g。

2.3.6 加样回收率

分别向已知格列苯脲和二甲双胍含量的供试品中加入各自含量的80%，100%，120%对照品，进样，测得峰面积，计算被测成分含量，用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。加样回收率实验结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

3 结 论

本文建立了薄层色谱鉴别法与高效液相色谱含量测定法快速有效的检测保健品舒宁胶囊中违法添加的降糖药格列苯脲和二甲双胍，该方法简便、准确可靠,可为相关部门检测保健品中非法添加降糖药物提供技术依据。