母乳中四环素类抗生素及其代谢产物的检测方法研究进展*

徐斯琦，李 强，苗 萌

(1 上海健康医学院医学技术学院，上海 201318；2 上海普陀区疾病预防控制中心理化检验科，上海 200333)

四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺四环素等，其结构均含并四苯基本骨架[1]。四环素类是主要抑制细菌蛋白质合成的广谱抗生素，高浓度具有杀菌作用，临床上用于多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体等所致之感染，此外，四环素也被广泛应用在畜牧业中，以此来促进动物生长、改善饲料利用率、降低死亡率等[2]，是最常见和最重要的抗生素之一。

1 母乳中四环素类抗生素对人类的影响

据卫生部的数据显示，我国已经成为世界上位列第一的抗生素使用大国，在医疗、畜牧、农产品等多个领域，抗生素的滥用现象都非常严重，我国已经意识到抗生素滥用所带来的巨大危害，并且制定了《抗菌药物临床应用指导原则》，以规范抗菌药物的临床应用[3]。母乳是产后女性乳房产生的用作哺育婴儿的汁液，富含各种婴幼儿成长必需的营养成分，如蛋白质、乳糖、脂肪、维生素和多种免疫球蛋白等，是新生儿降生初期最主要的营养物质来源。母乳喂养时间,一般认为以6个月到2岁为佳。但是，许多药物可以渗透到乳汁中通过喂奶进人婴幼儿体内，影响生长发育，如氯霉素、四环素、磺胺类药物等，因此，哺乳期妇女的各种药物暴露应该得到关注。动物源性食品作为哺乳期妇女必须摄入的食品，若被孕产妇长期低水平摄入抗生素，其造成的细菌耐药性、畜产品药物残留、过敏中毒反应以及“三致作用”等[4]，将直接威胁到人类特别是婴幼儿的健康与安危。根据目前的研究可以得知，哺乳期妇女服用四环素后，其分布于乳汁的浓度高于血液五倍，常规剂量就可致胎儿牙齿和骨骼发育不良、牙釉质缺损、灰色牙、棕色牙或黄色牙及短肢畸形、先天性白内障等[5]。新生儿即使短期服用四环素也极易引起乳齿的色素沉着。母亲如果在妊娠期服药，由于四环素能通过胎盘，也同样会对胎儿产生同样的影响，特别当妊娠已达六个月之后更易出现。此外，四环素类药物不稳定，生物体中易生成差向异构体，如差向四环素、差向土霉素、差向金霉素，一些四环素的差向代谢物活性减弱但毒性增强[6]。因此，研究四环素类药物的差向代谢物也具备重要的健康学意义。

母乳中四环素类抗生素及其代谢产物的测定，一方面可以作为哺乳期妇女的内暴露评估，另一方面可以作为婴幼儿食物的外暴露评估，具有双重的生物学意义。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)和液相色谱串联质谱法(High performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, HPLC-MS)，同时也有薄层色谱法(Thin layer chromatography, TLC)、毛细管电泳法(Capillary electrophoresis, CE)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELASA)等，具有各自的特点和应用范围，本文将对不同方法前处理过程与分析方法进行比较和阐述。

2 常用的检测方法

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱技术是一种快速而可靠的技术，对四环素类抗生素残留分析具有很高的灵敏度[7]，具有“高速、高效、高灵敏度、高自动化、应用范围广”等特点。李桂琴等[8]对比了 HLB 固相萃取柱、氨基柱和 C18柱，认为氨基柱对乳的净化效果最好，选取氨基柱为净化柱，0.1%甲酸-甲醇为洗脱剂，采用Waters Atalantis T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)，以水-乙腈(1:4，V/V)为流动相，建立了超高效液相色谱法对牛奶及奶制品中四环素类药物残留的分析，结果线性关系良好，回收率高。陈小燕等[9]选取HLB固相萃取柱为净化柱，0.1%甲酸-甲醇为洗脱剂，采用Venusil© XBP C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，0.01 mol/L草酸溶液+乙腈-甲醇(92:8,V/V)为流动相，建立了高效液相色谱法测定牛乳中四环素类抗生素的方法，对土霉素、四环素、金霉素和强力霉素四种四环素类抗生素的检出限在0.46～0.52 μg/L，远远低于国内外规定的最大残留限。

2.2 液相色谱串联质谱法

液相色谱串联质谱法依靠液相色谱系统进行分离，质谱系统进行检测，是液相色谱和质谱联用的一种技术。具有分离能力强、定性分析结果可靠、特异性强、自动化程度、灵敏度高等优势，被认为是目前“效果较好”的分析手段[10]。高志莹等[11]通过LC-MS/MS法，选取PLS固相萃取柱为净化柱, 10%甲醇-乙酸乙酯为洗脱剂, 采用Thermo Hypersil Gold色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)分离,以0.1%甲酸水溶液-乙腈(梯度洗脱)为流动相，成功测定牛奶中氯霉素和四环素类抗生素含量，得到四环素类抗生素检出限为0.5～10 μg/kg，该方法回收率高，相对标准偏差较小。段国霞等[12]选取HLB固相萃取柱为净化柱，甲醇-乙酸乙酯(1:9，V/V)为洗脱剂,选用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以0.1%甲酸水溶液+甲醇-乙腈溶液(1:1，V/V)为流动相，建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定乳中四环素类药物的残留，得到液态乳中四环素类抗生素的定量限为2 μg/kg，该方法线性范围宽，重复性好，适用于液态乳中四环素类抗生素的残留测定。

2.3 薄层色谱法

薄层色谱法是利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在流动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中，使组分互相分离[13]。其具有操作较简单、检测时间短、可定性定量等特点，是快速分离和定性分析少量物质的重要技术[1]。于新海等[14]在鉴定四环素类抗生素时采用薄层色谱法，以正丁醇-冰醋酸-水作为展开剂，5:2:3的配比体系在硅胶G薄层板上将土霉素进行展开时分离效果最佳。顾云等[15]对《中国药典》中用薄层色谱法鉴定四环素类抗生素的方法作了改进，将硅藻土手铺板改为默克硅胶60板F254，改用以水-甲醇-二氯甲烷(6:35:59)为展开剂，在365 nm的紫外光灯下检测，能产生较强的荧光，整个实验操作简便、快捷、分离度好、重现性好，可用于四环素类抗生素的检测。

2.4 毛细管电泳法

毛细管电泳技术是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的一种绿色技术，具有高效、快速、成本低、使用样本量少、可自动化、应用范围广等特点[16]。Islas G等[17]通过固相萃取结合大体积样品堆积毛细管电泳(SPE-LVSS-CE)的手段，根据牛乳样品中的金霉素、强力霉素、土霉素和四环素的电荷，在线进行预浓缩，使用具有光电二极管阵列检测器的毛细管电泳系统进行电泳。LVSS过程中，在流体动力学模式下使用5 Psi的压力的注入时间，施加电势和反极性时间。在最佳条件下，该方法的线性范围为29～200 μg/L，检测限为18.6～23.8 μg/L，重复性好，且只需要1.0 mL的牛奶，就足以分析低于最严格的最大残留限量的四环素。邵钰秀等[18]利用电堆积毛细管电泳法测定了乳中四环素、土霉素、强力霉素的抗生素残留，使用具有紫外分光光度检测器的毛细管电泳仪，以pH为2.5、20 mmol/L的柠檬酸盐溶液为缓冲液，分离电压20 kV，进样量为25 kV×30 s,检测的定量下限均为20 μg/kg，远低于欧盟标准中乳中四环素类抗生素的最大残留限量。

2.5 分子发光分析法

分子发光分析法是物质在光能、电能、化学能等作用下，从基态跃迁到激发态，在返回基态时以发射辐射能的形式释放能量，产生发光而建立起来的一种方法，具有灵敏度高、选择性好的特点[19]。分子发光分析法包括化学发光法、荧光分析法等。

通过化学发光法可以检测到四环素，四环素的化学发光是超弱化学发光，用肉眼不能直接看到，但可以通过单光子计数技术轻松检测到[20]。该方法检测简单，检测限低，检测成本低，使用中等复杂度的设备就获得合理的灵敏度，无需任何衍生化即可检测[20,21]。Li Jie等[22]将CL与HPLC结合，采用高效液相色谱-柱后化学发光法，通过铈(IV)与甲氧基化的辣椒素荧光素类似物系统之间反应能使四环素产生强烈化学发光信号的机制，对样品中的四环素抗生素残留进行了痕量分析。

四环素也能采用荧光分析法进行检测，利用其因吸收了光能而被激发出该物质特性的荧光，从而进行定性或定量分析。对于四环素这类本身不发射荧光或荧光微弱的物质，则需要加入一些试剂或物质，使其在特定的情况下转化成能发射荧光的物质或扩大其荧光强度[23]。荧光分析作为一种有效的检测方法，因其灵敏度高和预处理简单而被广泛应用于分析领域[24]。但是，由于荧光检测的选择性差，因此检测过程容易受到其他物质的干扰[25]。

2.6 分光光度法

四环素在一定的pH条件下，在紫外区对光有很强的吸收，通过测定其对光的吸收程度可以计算出其含量[26]。该方法灵敏度不够高，专属性较差，但也会被运用于简单的四环素的测定[27]。José Luiz Rufino等[28]已经开发出一种简单，快速，准确的分光光度法来测定四环素类抗生素，该方法基于四环素类抗生素能与氯胺-T在碱性介质中反应，从而产生红色产物，四环素和强力霉素的最大吸光度分别在535 nm和525 nm处，四环素和强力霉素的定量限分别为5.63 mol/L和0.71 mol/L，获得的结果准确、可靠。Sysay Palamy和Wirat Ruengsitagoon[29]开发了一种新颖的流动注射分光光度法，该方法基于强力霉素和植物提取物中所含的铁(III)之间形成的络合物在435 nm处有最大吸收峰来测定四环素类抗生素中的强力霉素，检测限和定量限分别为1.5 μg/mL和4.5 μg/mL，该方法具有操作简便、经济、高精度、高准确性等优点。

2.7 电化学法

电化学分析法，四环素在人体内的代谢过程与在电极上的氧化还原反应具有某些相似性[30]，所以，用电化学法测定四环素具有一定的可行性。且该方法具有灵敏度高、准确度高、测量范围广、操作简便等特点[31-32]。Calixto等[33]建立了石墨-聚氨酯复合电极法测定牛乳和母乳中的四环素，其在pH 2.3磷酸盐缓冲液中使用优化的差分脉冲伏安法参数在石墨-聚氨酯复合电极上获得的四环素检出限低至2.6 μmol/L。AyatMohammad-Razdari等[34]研究了一种基于笔形石墨电极修饰的纳米材料的阻抗式生物传感器的检测方法，该传感器可用于母乳样品中的四环素检测。该研究为提高电极表面的电子转移速率，选用RGO和AuNPs的组合作为纳米复合材料，在最佳条件下，适体传感器的浓度范围为1×10-16～1×10-6M，检测极限为3×10-17M TET。回收率达到92.8%～102.1%。将适体和电化学阻抗谱结合使用是检测牛奶样品中TET的一种有前途的方法，具有良好的可重复性，选择性和稳定性。

2.8 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是一种免疫学测定法，一般经过多重的抗原抗体反应后再与酶复合物结合，然后通过显色来检测的一种方法，由于操作简便快速，不依赖于大型仪器设备，广泛应用于样本的初筛和定性检测。曹金博等[35]建立了土霉素的酶联免疫检测法，该研究采用重氮化法在土霉素分子中引入羧基，使用改进碳二亚胺法将土霉素与载体蛋白偶联制备完全抗原，再通过红外扫描、紫外扫描和凝胶电泳鉴定其偶联效果，然后将制备的完全抗原免疫BLAB/c小鼠获得多抗血清，对其免疫学特性进行鉴定后通过优化条件建立土霉素间接竞争ELISA检测方法。方法的半数抑制浓度(IC50)为32.92 ng/mL，检出限为1.3 ng/mL。将其应用于牛奶样品的检测，加标回收率为84.70%～87.45%，与金霉素、四环素的交叉反应率分别为5.27%和4.10%，与其他竞争物交叉反应率<0.4%，是一种简便快速的土霉素检测方法。陈燕妮[36]建立了适合牛奶和蜂蜜样本检测的四环素测定的ELASA法。该研究通过合成四环素药物的完全抗原，利用抗体5B11建立了间接竞争ELASA法。该法对牛奶样品中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素的加标回收率分别为93.5%～101.2%、95.3%～105.1%、95.0%～101.5%、89.9%～92.3%，该法虽然有一定的抗体交叉反应，但操作简便快速，适用于牛奶样品四环素的快速检测。

3 结 语

母乳中四环素及其代谢产物的测定方法研究目前开展不多，而牛奶中相关研究较多。牛奶作为牛的母乳，样本的性质和人的母乳有很大的相似之处，相关检测方法可以作为重要参考。但是二者也存在一些差异，比如牛奶样本的营养素种类和量有一定差异，一些相关的生物蛋白也不一样，牛奶样本一般经过一定程度的加工，比如杀菌、水解等，而母乳则是直接供婴幼儿食用，二者本底基质有所不同。目前，高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法应用最为普遍，其他检测方法由于定性定量能力，或者设备普及原因，主要作为液相和液质法的重要补充。其中，高效液相色谱法由于其主要使用保留时间定性，抗基质干扰的能力也不足，方法的性能上不及高效液相色谱串联质谱法。随着液质联用仪的逐渐普及，其高定性能力和高灵敏度的优势逐渐显现，是母乳中四环素其代谢产物测定的研究方向。通过高性能检测方法的建立，逐步开展母乳相关四环素及其代谢物健康风险评估的工作，进一步了解四环素类抗生素对于孕妇和婴幼儿的健康影响，制定相应的防控建议，具有很好的公共卫生意义。