量子力学研究天然牛磺酸与DNA的相互作用*

廖 娟，玉 叶，王建超，文 彬，邓 鑫

(1 广西中医药大学，广西 南宁 530001; 2 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011)

量子力学是研究物质世界微观粒子运动规律的物理学分支，主要研究原子、分子、凝聚态物质，以及原子核和基本粒子的结构、性质。量子力学应用在生命科学中，主要用量子力学原理，通过数学运算来研究生物分子间的相互作用或作用方式，生物分子的电子结构与反应活性，生物大分子的空间结构与功能等[1]。DNA是生命体内重要的遗传物质，是基因表达的物质基础，它控制着蛋白质的合成，同时也是许多药物的靶向分子。药物是处在一个生物大分子和其他物质等所包围的复杂环境之中，药物与DNA相互作用也会影响到药物在生物体内各方面的性质，研究药物与DNA的相互作用，对药物的作用机制以及以核酸为靶标的药物分子的设计有一定的意义，将在临床用药治疗以及和新药的探索有着非常必要且重要的意义。

DNA分子双链间的螺旋型凹槽，有着空隙不等的大沟和小沟。深的为大沟，位于相毗邻的双链之间，较浅的为小沟位于双螺旋的互补链之间。在大沟和小沟内的碱基对中的N和O原子朝向分子表面，这些勾槽都有可能是药物与DNA作用的靶点。大沟区域是蛋白质大分子与DNA的特异性结合的位置，是蛋白质识别的碱基序列并发生相互作用的基础，且沟区足够大，允许蛋白质大分子的进入。然而，小沟的信息则少一些，小分子药物其体积小，更容易结合在DNA的小沟区。小分子药物与 DNA主要通过以下三种结合模式发生相互作用：分别为静电结合、沟区结合和嵌插结合[2]。

天然牛磺酸具有膜稳定、渗透调节和细胞保护作用、抗氧化和抗炎作用以及调节细胞内钙浓度和离子通道等功能[3]，牛磺酸在动物体内以原形排泄或与胆酸结合成牛磺胆酸，肌注和口服的生物利用度较高[4]，但天然牛磺酸在体内的药理作用尚未完全明了，本研究用光谱法、粘度法探究天然牛磺酸与DNA分子的相互作用，推测天然牛磺酸与DNA分子的结合方式、结合作用力。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

CARY8454紫外分光光度计，美国； Labsolutions RF荧光分光光度计，日本岛津；乌氏粘度计(毛细血管内径 0.55 mm)。

天然牛磺酸从乌蛤中提取，采用薄层色谱法定性定量检测牛磺酸(牛磺酸含量达到98%以上)；pH 为7.4 的 1M Tris HCI Buffer 缓冲液，购自福州飞净生物科技有限公司；小牛胸腺 DNA(ct-DNA)、吖啶橙(AO)，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 紫外线光谱的测定

在1 cm的石英比色皿中加入3 mL天然牛磺酸溶液,参比池中加入相同体积的双蒸水，扫描190～400 nm波长范围内的天然牛磺酸吸收光谱Ι0后，同时向参比池和样品池中逐渐加入相同体积(10 μL/L)的DNA缓冲液，混合均匀后静置15 min，扫描DNA缓冲液与天然牛磺酸相互作用后的吸收光谱Ι。根据公式(1)计算双倒数可求得结合常数KA[5]：

1/(A-A0)=1/A0+1/(KA×A0×CDNA)

(1)

式中：A0表示天然牛磺酸溶液在260 nm时的吸光度，A为加入DNA缓冲液后260 nm处的吸光度，KA为结合常数，CDNA为DNA缓冲液的浓度。

1.3 荧光光谱的测定

1.3.1 牛磺酸溶液对DNA缓冲液的荧光影响

不同浓度的DNA缓冲液存在下天然牛磺酸溶液的荧光光谱的变化：在Ex:312 nm，Em:330～650 nm，Ex，Em slit=5 nm，PMT Voltage:700 V的实验条件下，在1 cm的四面通光石英比色皿中加入3 mL天然牛磺酸溶液，测定天然牛磺酸溶液荧光光谱，之后向比色皿中逐渐加入等量的DNA缓冲液(10 μL/次)，混合均匀后静置15 min，测定DNA缓冲液对天然牛磺酸溶液的荧光光谱，测荧光强度，观察荧光光谱的变化。

1.3.2 牛磺酸对DNA缓冲液的淬灭反应

天然牛磺酸对DNA-AO复合体系荧光光谱的影响(荧光淬灭实验)：在Ex:495 nm，Em:510～650 nm，Ex，Em slit=5 nm，PMT Voltage:700 V的实验条件下，在1 cm的四面通光石英比色皿中加入3 mL DNA缓冲液，测定荧光光谱后，取等量的AO溶液加入另一个石英皿中，测定荧光光谱，取DNA缓冲液3 mL加入试管中，并加入浓度为5.05×10-6mol·L-1的AO溶液15 μL，定容至5 mL后，取3 mL该溶液至比色皿中测量其荧光强度，观察DNA与AO结合后荧光增强反应。随后，测定DNA-AO溶液(CDNA/CAO=20)荧光强度F0，向溶液中逐渐加入等量的不同浓度的天然牛磺酸溶液，测荧光强度F，观察随着天然牛磺酸溶液的加入对DNA-AO溶液的荧光光谱的影响。根据经典的Stern-Volmer方程(式2)当温度一定时，F0/F～KQ呈线性关系，以F0/F～[Q]作图，所得直线的斜率可求出KQ值。

F0/F=1+KQ[Q]

(2)

式中：F0/F为未加入淬灭剂时溶液的荧光强度F0与加入给定浓度的淬灭剂时溶液的荧光强度F的比值；KQ为Stern-Volmer淬灭常数，Q为淬灭剂的浓度。

1.4 粘度法

将恒温槽中水浴温度恒定在25 ℃，粘度计中加入20 mL DNA缓冲液，测定溶液通过毛细管所花费的时间t0(s)，之后逐渐加入天然牛磺酸溶液(10 μL/次)，测定混合溶液流过毛细管所花费的时间t(s)。按式(3)计算相对粘度η：

η= (t-t0)/t0

(3)

式中：t0位缓冲液流经毛细管所需时间，t为DNA缓冲液(含浓度不等的天然牛磺酸)流经毛细管所需时间，η0为没有加入天然牛磺酸时DNA缓冲液的相对粘度。以(η/η0)1/3对结合比率r(r=C天然牛磺酸/CDNA)作图，看曲线趋势可知粘度变化。

2 结果与讨论

紫外线吸收光光谱法根据电子跃迁光谱，吸收光波长范围为200～400 nm，用于结构鉴定和定量分析。天然牛磺酸溶液与DNA缓冲液的吸光度如图1(a)所示，吸收光较弱，随着DNA缓冲液的逐渐加入，吸光谱出现了逐渐的增强，并波峰往右移(如图1(b))。已知由于嘌呤和嘧啶基团中含有发色基团，ctDNA在260 nm处有特殊的π→π*带，因此在天然牛磺酸溶液中随着DNA缓冲液的加入，此封逐渐增强，在190～200 nm处为天然牛磺酸的吸收峰，逐渐加入DNA缓冲液时，此处峰值增强并右移，有可能是由于两者结合导致了ctDNA氢键的破坏，引起π→π*电子的跃迁，共轭延长，因此吸光谱出现增色反应，并有轻微的红移现象。根据双倒数公式，求得结合常数KA=1.68×104L·mol-1，说明天然牛磺酸与DNA发生了相互作用，引起了构象的变化，但EB与DNA的结合常数为1.4×106L·mol-1，即天然牛磺酸与DNA结合力度较EB小，也有可能存在其他方式的相互作用。

图1 天然牛磺酸溶液加入DNA后紫外线吸收光谱变化

天然牛磺酸溶液荧光光谱如图2所示，逐渐加入DNA缓冲液后(10 μL/次)，天然牛磺酸溶液的荧光光谱出现了有规律的增强(a→b)，峰值未见明显红移或蓝移现象。天然牛磺酸是一种荧光强度较低的物质，加入DNA缓冲液时，可能自身的荧光淬灭受到了抑制，出现荧光增强的反应，但这也可能是DNA的发光团增加的作用。

图2 加入DNA后天然牛磺酸的荧光光谱变化

DNA是荧光强度较低的物质，AO是一种荧光色素[6]，与DNA以经典嵌插方式相结合，能嵌插入DNA碱基对之间，形成DNA-AO复合物后可以出现较高的绿色荧光，能更好的辨别荧光反应，对比单纯DNA缓冲液和纯AO溶液的荧光强度如图3所示。

图3 DNA与AO、DNA-AO复合物荧光强度对比

图4 天然牛磺酸竞争DNA-AO复合物的荧光光谱变化

若配体AO结合位点相同，则会通过位点竞争置换出AO，使荧光强度逐渐降低，出现有规律的淬灭反应。在逐渐加入天然牛磺酸后，荧光强度确实出现逐渐降低，推测是由于天然牛磺酸与AO竞争DNA上的作用位点，因此出现有规律的荧光淬灭反应，如图4左侧所示，根据经典的Stern-Volmer方程[7]：F0/F=1+KQ[Q]，用F0/F对[Q]作出Stern-Volmer曲线图，如图4右侧，求其斜率可以得出KQ=2.944。

粘度法是研究小分子药物与DNA相互作用的经典方法之一[8]。其插入DNA的碱基对后与碱基对重叠排列，并依靠氢键、范德华力和大环的π-π堆积作用而产生较稳定的结构，受离子强度的影响小，故粘度法是嵌插方式结合的最有说服力的研究方法。恒温槽中水浴温度恒定在25 ℃，粘度计中加入20 mL DNA缓冲液，测定溶液通过毛细管所花费的时间t0(s)，之后逐渐加入天然牛磺酸溶液10 μL/次，测定混合溶液流过毛细管所花费的时间t(s)。按式η=(t-t0)/t0计算相对粘度，以(η/η0)1/3对结合比率r(r=C天然牛磺酸/CDNA)作图，如图5所示，随着天然牛磺酸浓度的加大，粘度也出现逐渐的增大，DNA双链为融入小分子药物而被拉长[9]，提示天然牛磺酸可能以嵌插的方式与DNA结合，与荧光结果相对应。

图5 (η/η0)1/3对结合比率r(r=C天然牛磺酸/CDNA)

3 结 论

(1)通过紫外-可见吸光光谱法、荧光光谱法、粘度法探讨天然牛磺酸与DNA分子的相互作用。结果显示天然牛磺酸与DNA发生了相互作用，可能主要通过嵌插结合方式，其结合常数为1.68×104L·mol-1，淬灭常数为2.944，其作用力类型可能是氢键或者范德华力。

(2)本研究仅使用了紫外可见吸收光谱法、荧光光谱法、粘度法做了基础研究，用化学计量学方法对光谱结果做出了定量分析天然牛磺酸与DNA相互作用，推测可能的作用力类型和结合能力，但未能进一步探明两者结合后的空间构象如何变化，结合后DNA双链结构更加稳定，结合在有表达意义的DNA片段上还是在无意义的外显子上是未知的，但结合后对DNA的转录、翻译等是否存在影响或者怎样发生作用尚未可知，是否通过嵌插方式与DNA结合，调控、改变基因序列，影响了转录和翻译仍需进一步证实。

(3)从量子层面分析分子间的相互作用在材料科学(尤其是纳米材料)[10]、分子生物学领域发挥着重要的影响，有利于研发更精准的靶向治疗药物。人们对DNA与靶分子的相互作用研究取得了一定的理论与实际应用成果，但也存在着很多未能明了的问题：在研究方法上，因DNA序列、转录、翻译的复杂性，DNA与药物小分子相互作用的精细结构位点未能逐一明确，也没有超精细的仪器能使DNA结构像病理组织一样清晰地展现在显微镜上；且研究方法多种多样，没有一个全面系统的研究方法，都是零星研究，且方法不同分析的结果还会存在差别，需要进一步评估方法和结果。在生物反应中，药物小分子经口-胃-肠-肝等较复杂的消化系统，即使是直接注射到血液中，血液成分也存在多种流动物质，故药物小分子与DNA作用并不仅限于体外实验这样纯净，干扰因素较多，而且更深层次的结合规律还未知。但随着量子化学、量子生物学、量子力学等微观学科的发展，动物体内与药物小分子相互作用的量子分析会更加清晰。