工业化提取中药王不留行中黄酮苷和刺桐碱的工艺探究

戚梦婷，侯 豹，蔡维维，孙姜楠，艾 敏，马欣雨，邱丽颖

(1 江南大学药学院，江苏 无锡 214122；2 江南大学医学院，江苏 无锡 214122)

王不留行是石竹科植物麦蓝菜Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟种子，其主要功效为活血通络，下乳消肿，利尿通淋等[1]。王不留行中主要含有三萜皂苷、环肽、类脂、多糖、黄酮苷和刺桐碱等[2]。其中黄酮苷和刺桐碱是具有多种药理作用，黄酮苷具有促内皮细胞增殖[3]，在开放性创伤的治疗中取得了显著的效果[4]，刺桐碱可以减轻脂多糖诱导的Raw 264.7细胞和内皮细胞的炎症反应[5-6]。

已有研究对刺桐碱提取工艺研究较多，但提取工艺比较复杂，耗材较多[7-8]，不适宜工业生产。中国药典中也对王不理行黄酮苷和刺桐碱的提取分离以及效用做了详细说明，但其提取工艺应用于工业化生产还缺乏理论数据支持。因此本实验选择通过索式提取[9]考察了生和炒王不留行的含油量，选择含油量较低的生王不留行在室温下通过乙醇浸渍法提取王不留行黄酮苷和刺桐碱，并用高效液相色谱法同时测定黄酮苷和刺桐碱含量，为工业化提取提供参考。

1 材料与试药

Waters 1525高效液相色谱仪，Waters公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SZ-1000A-3超高速多功能粉碎机，永康市善竹贸易有限公司；AX124ZH/E电子天平，奥豪斯仪器有限公司；Milli-Q纯水仪，Millipore公司；KQ-800KDE高功率数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；BZF-50真空干燥箱，上海博迅实业有限有限公司。

王不留行，安国庆药源商贸有限公司；黄酮苷对照品(纯度>98%)，上海土锋生物科技有限公司；刺桐碱对照品(纯度>98%)，上海土锋生物科技有限公司；甲醇(HLPC级)，Adamas公司。

2 实验方法

2.1 索氏抽提测生王不留行和炒王不留行种子的含油量

分别取生王不留行和炒王不留行约3 g，研磨并置于滤纸中，加入50 mL石油醚，在65 ℃下提取5.5 h，计算其含油率。

2.2 建立同时测定黄酮苷和刺桐碱含量的HPLC测定方法

色谱条件：色谱柱为X-Bridge C18(4.6×250 mm，5 μm)；按照中国药典收录的检测方法，以甲醇为流动相A，0.3%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～10 min、35%A，10～20 min、35%～40%A，20～35 min、40%～50%A)；检测波长为280 nm，检测波长流速为0.5 mL/min；进样量为10 μL。

2.3 溶液的制备

分别精密称取黄酮苷和刺桐碱5 mg，置于50 mL容量瓶中加70%甲醇水溶液溶解定容摇匀即得对照品混合溶液。准确称取样品50 mg用70%甲醇定溶于50 mL容量瓶，经0.22 μm的滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.4 线性关系的考察

再分别稀释成1、12.5、25、50、100 μg/mL对照品溶液进样。以黄酮苷和刺桐碱的浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。黄酮苷回归方程为Y= 22949x-2488.2，R2=1；刺桐碱的回归方程为Y=24004x-6249.1，R2=0.9999，黄酮苷和刺桐碱在1～100 μg/mL浓度范围与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 单因素考察

(1)准确称取5份王不留行种子粗粉，每份10 g，固定乙醇浓度为75%，提取3天。分别以料液比为1:6、1:8、1:10、1:12、1:14提取，考察提取料液比对提取王不留行中黄酮苷和刺桐碱含量的影响。

(2)准确称取5份王不留行粗粉，每份10 g，固定料液比为1:10，乙醇浓度为75%，考察提取时间对提取王不留行中黄酮苷和刺桐碱含量的影响。

(3)准确称取5份王不留行粗粉，每份10 g，固定料液比为1:10，提取3 d，考察乙醇浓度对提取王不留行中黄酮苷和刺桐碱含量的影响。

2.6 正交试验

根据单因素试验的基础上，采用正交试验L9(34)，以提取料液比、提取时间、乙醇浓度为3因素，每个因素选择三个水平设计正交表见表1。正交试验以黄酮苷和刺桐碱含量及干粉得率为评价指标，权重系数分配为黄酮苷刺桐碱的含量各占0.45，干粉得率占0.1。

表1 L9(34)正交试验因素水平

2.7 验证试验

根据正交试验得出的最佳提取工艺提取三次，考察方法的稳定性和重复性。

3 结果与讨论

3.1 王不留行种子中含油量测定

经检测生王不留行和炒王不留行含油量分别为2.8471%、3.2492%。生王不留行和炒王不留行含油量都低于百分10%，为了减少常规石油醚脱脂步骤，减少污染，因此选用生王不留行种子提取黄酮苷和刺桐碱。

3.2 王不留行黄酮苷和刺桐碱色谱图

王不留行黄酮苷和刺桐碱标准品HPLC图谱见图1A，生王不留行种子提取物HPLC指纹图谱见图1B。

图1 王不留行黄酮苷和刺桐碱标准品(A)及

3.3 单因素考察结果

分别以料液比为1:6、1:8、1:10、1:12、1:14提取，结果如图2A所示黄酮苷和刺桐碱含量都随着溶剂增大而增大在料液比1:12时达到最大，而当料液比1:14时黄酮苷和刺桐碱的提取量并没有随之增大，因此选择1:10、1:12、1:14进行正交试验设计。

分别以提取时间为1、2、3、4、5 d提取，考察提取时间对提取王不留行中黄酮苷和刺桐碱含量的影响。如图2B所示在第3天达到最高，因此，选择含量最高的2、3、4天作为正交试验设计。

分别以乙醇浓度为55%、65%、75%、85%、95%提取，考察乙醇浓度对提取王不留行中黄酮苷和刺桐碱含量的影响。如图2C所示，当乙醇浓度达到75%时黄酮苷和刺桐碱的含量达到最大，当乙醇浓度达到85%和95%时，黄酮苷和刺桐碱的提取量反而降低。因此选择65%、75%、85%进行正交试验。

图2 料液比、时间、乙醇浓度对提取黄酮苷和刺桐碱含量的影响

3.4 正交试验结果

正交试验结果的直观分析和方差分析见表2和表3，综合极差和方差分析知浸渍法提取王不留行黄酮苷和刺桐碱含量影响因素程度为A(料液比)>C(乙醇浓度)>B(时间)，料液比对王不留行黄酮苷和刺桐碱含量有显著影响。综合直观分析和方差分析可以确定浸渍法提取王不留行黄酮苷和刺桐碱最佳提取工艺为A3B3C2，即料液比1:14，提取时间4 d，乙醇浓度75%。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析表

3.5 验证试验结果

如表4所示为三次平行试验的结果，根据正交试验结果选定最佳提取工艺料液比1:14，提取时间4 d，乙醇浓度75%的最佳提取工艺稳定可靠。

表4 最佳提取工艺稳定性考察表

4 结 论

王不留行黄酮苷和刺桐碱因为其良好的药效而受到科研工作者的广泛关注。对其需求量也逐渐增加，因此开发一个可工业化提取的生产工艺迫在眉睫。本研究选择不同的药液比、乙醇浓度、提取时间进行单因素试验和正交试验，得出了浸渍法

提取王不留行黄酮苷和刺桐碱的最佳提取工艺为料液比1:14，提取时间4 d，乙醇浓度75%。黄酮苷和刺桐碱在最佳提取工艺下的含量分别为5.37 mg/g和1.22 mg/g，为工业生产奠定了一定的理论基础，提供了数据支撑。本研究提取起方法简易、耗能少、成本低，具有很好的工业化价值。但浸渍法提取也存在耗时较长的缺点，且本实验是在室温直接使用粗粉进行提取，在温度和粉碎粒度等因素方面还有待进一步的考察。