透析袋法测定经皮给药柔性脂质体中欧前胡素的包封率*

许 源，莫镇杰，张 彦，陈智聪，罗娇艳，班俊峰

(广东药科大学，广东 广州 510006)

白芷是中药中常用于发挥解表、祛风散寒、燥湿与止痛等功效的药材，其药用始载于《神农本草经》[1-3]。化学成分表明异欧前胡素、欧前胡素等香豆素类成分是白芷中的主要成分之一，《药典》中白芷“鉴别”项下明确以欧前胡素和异欧前胡素为对照，“含量测定”项下明确以欧前胡素为检测指标进行含量测定。白芷在临床上常用于治疗头面部疼痛及疮疡肿痛等类型的疼痛症状，在治疗等方面，经适当配伍更可以广泛应用于全身各部位的疼痛病症。虽然白芷被广泛应用于临床解热镇痛的方剂中，但对于其有效成分欧前胡素经皮给药缓解疼痛的相关研究较少[4-6]。柔性脂质体结构与机体生物膜类似，是一种多功能的定向药物载体。其在经皮给药系统中的应用，可使皮肤结构中表皮和真皮内的药物量增多，并形成药物储库。即达到了增强药物渗透量使药物直接到达身体特定部位起效，又起到了减少药物进入血循环中的量避免首关效应发生的作用[7]。柔性脂质体因其独有的特点，在经皮给药系统中已有广泛研究。目前柔性脂质体仍存在有储存期颗粒易团聚、磷脂成分氧化导致的活性成分含量降低、样品储存期内粒径分布、PDI和Zeta不稳定等问题严重限制了其在经皮给药系统中的开发和应用。本研究通过建立透析袋法测定了欧前胡素柔性脂质体中的包封率，考察了制备工艺过程中影响药物含量的制备因素，研究可为欧前胡素经皮递药系统的开发提供技术支持，为开发高渗透量的产品提供理论参考。

1 仪器与试药

CP225D电子分析天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；Waters e2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；JY88-LIN超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；L-100XPRE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；THZ-82水浴恒温振荡器，江苏省金坛市宏华仪器厂。

欧前胡素对照品，中国药品生物制品检定所(批号：110826-201616，纯度：98%)；欧前胡素原料药，上海历鼎生物技术有限公司(批号：160118，纯度：97%)；欧前胡素柔性脂质体，自制(批号：20190301-1、20190301-2、20190301-3)；空白欧前胡素柔性脂质体，自制(批号：20190301)；水为蒸馏水；有机试剂均为分析纯，液相用试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 欧前胡素柔性脂质体的制备

表1 欧前胡素柔性脂质体处方组成

采用薄膜分散法制备脂质体[8]，称取处方量的欧前胡素(IMP)，大豆卵磷脂，胆固醇于圆底烧瓶中，加入10 mg·mL-1的吐温-20乙醇溶液水浴加热溶解，利用旋转蒸发仪，55 ℃水浴挥去乙醇，PBS溶液(pH=7.4)水化 30 min后取出，将所得溶液置于烧杯中，冰浴条件下70 Hz 细胞破碎超声10 min，即得1 mg·mL-1的欧前胡素柔性脂质体溶液。

2.2 欧前胡素的含量测定

2.2.1 色谱条件

YMC C18column色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：297 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流动相：甲醇：水(70:30，V/V)。

2.2.2 专属性考察

取IMP对照品溶液、供试品溶液及空白供试品溶液适量，采用HPLC法，按2.4项下色谱条件进样分析。结果如图1所示，表明欧前胡素柔性脂质体中的辅料对欧前胡素的含量测定无干扰，欧前胡素的保留时间为9.6 min。

图1 HPLC色谱图

2.2.2.1 对照品贮备液的制备

精密称取欧前胡素对照品10.19 mg于100 mL量瓶中，用甲醇超声溶解定容得0.1019 mg·mL-1对照品溶液。

2.2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取自制欧前胡素柔性脂质体0.1 mL(IMP含量为0.5 mg·mL-1)于10 mL量瓶中，甲醇超声溶解并定容，采用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2.3 空白供试品溶液的制备

精密称取空白欧前胡素柔性脂质体0.1 mL于10 mL量瓶中，按2.2.2.2项下 “供试品溶液制备”方法制备。

2.2.3 线性考察

精密量取2.2.2.1项下对照品贮备液适量，用甲醇溶解稀释并定容，配制成质量浓度为0.1019、0.5095、1.019、5.095、10.19、20.38 μg·mL-1的系列溶液，按2.2.1项下色谱条件进样分析，以药物峰面积A(mAU)对药物浓度C(μg·mL-1)进行线性回归，得回归方程为A=49121C-267.97(R2=0.9999)。结果表明IMP浓度在0.1019～20.38 μg·mL-1范围内与其峰面积线性关系良好。

2.2.4 精密度实验

分别各取2.2.2.1项下欧前胡素对照品和2.2.2.2项下供试品溶液6份，按2.2.1项下色谱条件进样分析，连续重复进样6次，记录峰面积。表2结果显示，欧前胡素对照品峰面积的RSD值为0.35%(n=6)，表明仪器精密度良好；欧前胡素供试品峰面积的RSD值为0.47%(n=6)，表明本方法重复性良好。

表2 回收率试验结果

2.2.5 加样回收率实验

取已知含量的欧前胡素柔性脂质体9份，分别加入一定量的IMP对照品溶液，加甲醇稀释并定容，进样分析并记录峰面积。结果表明，三种浓度的加样回收率在97.34%～101.03%之间，三个浓度梯度的平均回收率分别为97.34%、101.03%、99.18%(n=3)，RSD值分别为0.57%、0.09%、0.06%(n=9)，表明该方法的准确度良好，详见表2。

2.3 包封率的测定

2.3.1 透析袋的前处理

将透析袋(分子截留量3000)置于1 mmol·L-1的EDTA 与2% NaHCO3溶液中煮沸20 min，冷却至室温后，用蒸馏水将透析袋里外冲洗干净，再用蒸馏水加以煮沸10 min，冷却至室温后将透析袋浸泡于70%的乙醇溶液中进行保存，使用前需用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。

2.3.2 透析平衡时间

取欧前胡素柔性脂质体0.5 mL于透析袋中，首尾密封扎紧，置于50 mL离心管中，以0.5%吐温-80为释放介质，取20 mL加入至离心管中，在37 ℃，100 rpm·min-1状态中水浴振荡，保证欧前胡素脂质体处于“漏槽条件”下，于2，4，6，8，10，12 h时各取2 mL释放介质，每次取出后补回2 mL同温度的释放介质。取出的样品采用0.22 μm滤膜过滤，按2.2.1项下色谱条件进样分析，计算药物浓度C，以药物浓度C为纵坐标，取样时间t为横坐标作透析平衡时间曲线，以确定透析平衡时间，结果如图2所示。

图2 欧前胡素柔性脂质体透析平衡时间曲线

由平衡时间曲线可知，8 h后，欧前胡素柔性脂质体处于平衡状态，药物浓度在8～12 h内变化不大，稳定性良好，为保证柔性脂质体透析平衡完全，选择以10 h为药物的透析平衡时间。

2.3.3 包封率的测定

精密移取透析平衡时间为10 h时的样品1 mL置于10 mL量瓶中，适量甲醇超声溶解并定容，采用0.22 μm滤膜过滤，按2.2.1项下色谱条件进样分析，计算欧前胡素总的药物含量，并按公式(1)计算欧前胡素柔性脂质体的包封率EE。

(1)

经计算，10 h时药物含量为0.1%的欧前胡素柔性脂质体的包封率为58.39%±3.64%。

3 结 论

本研究以大豆卵磷脂为脂质材料，采用薄膜分散法制备欧前胡素柔性脂质体，所制备的脂质体为淡黄色、均一稳定的溶液制剂。采用的检测方法为高效液相色谱法，经过验证该方法适用于欧前胡素柔性脂质体的方法学测定，所建立的分析精密度高，变异系数小，可快捷、准确地测定欧前胡素柔性脂质体的含量和包封率，且专属性强，可用于质量控制。

脂质体测定包封率的方法常用葡聚糖凝胶柱色谱法、透析袋法和超速离心法等，本实验采用透析袋法作为欧前胡素柔性脂质体的包封率测定方法，与葡聚糖凝胶柱色谱法和超速离心法相比，缺点为过程缓慢，时间较长，其优点为脂质体膜不易渗漏或被破坏，适合用于分离小分子药物，该方法稳定可靠且利于取样分析。