干姜化学成分的分离及抗肿瘤活性成分筛选*

陈 靖，柴 玲，谭 敏

(1 常德职业技术学院药学系，湖南 常德 415000；2 广西中医药研究所 广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022)

干姜 (Rhizoma Zingiberis) 源自姜科植物姜(ZingiberofficinaleRose.)的干燥根茎，是常用药食同源的中药材。干姜具有极好的药用价值，为《本草纲目》、《本草经疏》等记载。其性热味辛，功效为温中散寒，回阳通脉，温肺化饮[1]。

临床上主要用于治疗肠炎、腹泻、呕吐、外感风寒、冠心病、心肌梗塞、手足皲裂等疾病[2]。干姜主要含有挥发油类成分，现代药理学研究表明，干姜及其活性成分对肺癌[3]，结肠癌[4]，胃癌[5]，肝癌[6]，白血病细胞[7]具有抗肿瘤作用。近年来，美国及欧洲各国开始将干姜用于食品添加剂中[8]。由此可见，干姜作为一种药食同源的中药材，在当前中医临床中应用广泛，其药效显著，且毒副作用小。因此为了深入探讨干姜的药效物质基础，加强对干姜活性成分的系统研究和开发利用，我们对其进行了化学成分及抗肿瘤活性研究。

1 材料与仪器

1.1 仪器与设备

常规分析采用岛津LC-10A VP高效液相色谱系统(包括(LC-10AD二元泵、SIL-10AD自动进样器、LC-10A系统控制器和SPD-10A UV-VIS检测器)，日本岛津株式会社；色谱工作站采用岛津CLASS-VP Ver6.12 SP4色谱工作站；BÜCHI Rotavapor R-200旋转蒸发仪，瑞士BÜCHI公司；BP211D十万分之一天平，德国Sartorius公司；Labconco冻干机，美国Labconco公司； 生物安全柜，苏州净化设备有限公司；细胞培养箱，美国Thermo公司；倒置显微镜，日本Nikon公司；Victor 3多功能酶标仪，美国Perkin Elmer公司；恒温水浴锅，德国LAUDA公司；高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司。

1.2 材料与试剂

姜超临界流体萃取所得的姜油树脂，广州和博生物科技有限公司有限公司；甲醇(色谱纯)，江苏汉邦科技分析有限公司；乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)，美国Tidea公司；水为超纯水，(Millipore，Bedford，MA，USA)制备。其它试剂均为分析纯。

肝癌细胞株SMMC-7721，Bel-7404, HL-7702均购自中科院上海细胞库。HepG2细胞购自美国ATCC细胞库；RPMI1640培养基，胎牛血清，胰酶等细胞培养用试剂购自美国Gibco公司；MTT购自美国Sigma公司。

2 实验方法

2.1 色谱条件

称取约50 mg姜油树脂，溶解至1 mL。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，4.6×150 mm，5 μm；流动相为A：纯水，B乙腈；梯度洗脱：0～9.0 min，B相80%；9.0～10.0 min，B相80%～100%；10.0～20.0 min；B相100%；20.0～21.0 min，B相100%～80%；21.0～25.0 min；B相80%)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：15 μL。根据DAD光谱及出峰顺序，分别判断其中1～5号主要色谱峰。

图1 HPLC-UV 姜油树脂色谱图

图2 HPLC-UV 姜油树脂分离色谱图

2.2 化合物累积

称取约250 mg姜油树脂，用甲醇溶解至1 mL。每次分析进样15 μL，色谱条件如前述。其色谱如图2所示。根据保留时间分辨每个化合物的出峰时间。按出峰时间精确收集色谱峰尖端，即可得到分别包含各个化合物的馏分。收集时的时间顺序见表1。各个馏分在旋转蒸发仪上蒸去乙腈后冻干，所得化合物-70 ℃冷冻保存。

表1 HPLC分离姜油树脂采集时间

2.3 化合物纯化

上步所得粗品经分析型HPLC进一步纯化，将其纯度进一步提高。各个化合物馏分通过HPLC-UV法，经峰面积归一化法确定，其纯度高于98%。

2.4 抗肿瘤活性筛选

2.4.1 给药药物制备

将从干姜中分离得到的5个姜酚类化合物用无血清培养基配置成5, 10, 20, 40, 80, 160，320 μM浓度的药物溶液；将干姜提取物配置成10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 μM浓度的药物溶液。

2.4.2 MTT试验

将细胞接种于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于5% CO2培养箱37 ℃培养。所有试验均选取对数生长期的细胞。

用0.125%胰酶消化并收集细胞，以每孔1×104个细胞铺96孔板。培养24 h后将培养基吸出，加入不同浓度的药物(用RPMI1640培养基将6-shogaol分别稀释成5、10、15、20、25、30 μM)，每浓度做4个平行孔，另设空白孔和对照孔。药物作用期间，在不同时间点用倒置显微镜观察细胞的形态学变化与生长情况。

药物作用24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，混匀后继续培养4 h。取出细胞培养板，吸出上清，每孔加DMSO100 μL，震荡均匀，使紫色结晶物充分溶解，用酶标仪，波长490 nm测定各孔的吸光度(OD)值，按下列公式计算细胞抑制率。

将细胞用不同浓度的药物分别处理3，6，12，24 h后于倒置显微镜下观察细胞形态。

3 实验结果

3.1 化合物鉴定

将分离纯化得到的化合物TOF/MS质谱数据与标准品比对，鉴定出化合物1为 6-gingerol；化合物2为 8-gingerol；化合物3为 diacetoxy-6-gingerdiol；化合物4为 6-shogaol；化合物5为 10-gingerol，质谱数据见表2。结构见图3。

表2 姜油树脂中的化合物鉴定

图3 姜油树脂中化合物的结构 (A) n=4 6-gingerol，n=6 8-gingerol, n=8 10-gingerol; (B) 6-shogaol;(C) diacetoxy-6-gingerdiol

3.2 抗肿瘤活性分析

MTT实验筛选结果表明干姜中6-gingerol，6-shogaol及干姜提取物对肝癌细胞均有细胞毒性，其中6-gingerol对肝癌细胞毒性作用没有线性关系，起效浓度高。160 μM以下对该癌细胞没有毒性，320 μM细胞毒性显著上升。干姜提取物40 μg/mL为起效浓度，60 μg/mL作用24 h可致细胞急速死亡。而6-shogaol对肝癌细胞有细胞毒性且呈浓度依赖性。其中对SMMC-7721细胞毒性最为明显。20 μM 6-shogaol 作用24 h约抑制50% SMMC-7721细胞增殖，如图4所示。正常培养条件下的SMMC-7721细胞为饱满的多边形，贴壁生长，相邻细胞生长融合成片，细胞均匀生长，状态良好。经6-shogaol处理后，细胞间连接消失，细胞由贴壁逐渐脱落，胞体变圆，收缩，细胞分散生长，细胞形态变得模糊，不完整，如图5所示。

图4 6-shogaol对肝癌细胞的细胞毒性

图5 20 μM 6-shogaol 处理SMMC-7721细胞24 h后的形态学变化

4 讨 论

4.1 分离姜油树脂中化合物的方法

采用分析型HPLC反复进样，累积目标馏分的方法分离富集目标化合物，这种方法要求将样品制成尽可能浓的溶液，摸索适宜进样量，尽可能增加进样量而不致超载。本实验表明，用分析型HPLC累积的姜中主要成分是可行的。特别是对于含量小、极性相近，采用传统分离方法不易分离得到的化合物，采用分析型HPLC能很容易检测并分离得到。另外此方法累积化合物，分析条件简单容易摸索，与传统分离方法比较，可大大缩短所需化合物的分离时间，可应用于mg级别化合物的短期快速累积。

4.2 抗肿瘤活性成分的筛选

抗肿瘤作用筛选结果表明，干姜提取物及干姜姜油树脂中的6-gingerol、6-shogaol有肝癌细胞毒性，6-gingerol和干姜提取物对细胞呈急剧性死亡没有浓度依赖性，而6-shogaol对肝癌细胞毒性呈浓度依赖性。本研究工作为干姜中活性成分的研究找到了很好的天然资源，也为干姜后续研究奠定了基础。