高效液相色谱法测定叶下珠没食子酸含量的研究*

唐 艺，李 昆，许 斌，陈舒忆

(贵阳市食品药品检验检测中心,贵州 贵阳 550081)

叶下珠为大戟科植物叶下珠Phyllanthusurinaria Linnaeus 的干燥全草，有平肝清热、利水解毒的功效[1]，临床上，叶下珠多用于慢性乙型病毒性肝炎的治疗[2]。叶下珠的活性成分较多，其中没食子酸含量最高，有抗炎、抗突变、抗氧化、抗肿瘤活性。本文对叶下珠的含量测定方法进行研究，为叶下珠的质量控制提供一定的依据。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪Agilent1260，安捷伦；电子天平BSA224S，赛多利斯；水浴锅DFD-700，天津市泰斯特；没食子酸对照品(批号：110831-201605)，中国食品药品检定研究院。色谱纯甲醇(4 L/瓶)，默克化工技术；盐酸、磷酸(500 mL/瓶)，国药集团化学试剂。

1.2 实验材料

10批不同产地的叶下珠(见表1)，采集部位均为全草，并由贵州中医药大学药学院魏升华教授鉴定为大戟科叶下珠属植物叶下珠Phyllanthusurinaria L.。

1.3 实验方法

1.3.1 液相色谱条件

InretSustain C18色谱柱(4.6×250 mm，5.0 μm)，甲醇-0.2%磷酸溶液(12:88)为流动相，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温25 ℃，检测波长273 nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于3000。

1.3.2 溶液的制备

取叶下珠粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入15%盐酸溶液50 mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用15%盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL，用50%甲醇定容至10 mL，得供试品溶液。取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱中测定，按外标法以峰面积计算。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

通过查阅药典，没食子酸的含量测定的前处理方法有两种方式，甲醇提取和盐酸溶液提取。故分别采用40%甲醇、50%甲醇、10%盐酸、15%盐酸、20%盐酸进行回流和超声进行提取测定，定容体积均为25 mL。结果显示，用15%盐酸溶液回流1 h进行提取测定没食子酸含量最高，故选择此方法。

2.2 色谱条件的确定

参照相关文献[3-5]，对不同的流动相和柱温进行相关研究，在甲醇-0.2%磷酸溶液(12:88)，柱温25 ℃时，叶下珠药材的色谱分离效果良好，没食子酸成分能被有效定量，见图1。

图1 没食子酸对照品和叶下珠的HPLC图谱

2.3 10批不同产地的叶下珠的没食子酸含量

表1 样品来源表和没食子酸含量

2.4 回收率、精密度、耐用性和线性考察

2.4.1 回收率

表2 没食子酸的回收率

精密称取6份同一批次样品，其中对照品没食子酸加入量与叶下珠含量为 1:1，进行回收率测定，回收率范围在98%～100%，结果见表2。

2.4.2 精密度

将6份同一批次样品，进行没食子酸含量的测定，RSD为1.0%，结果见表3。

表3 没食子酸的精密度

2.4.3 耐用性

对同一批次样品的没食子酸含量的耐用性(稳定性)进行考察，选择多个时间点上机分析。结果表明，没食子酸峰面积在26 h内无明显变化，RSD为0.4%，且保留时间稳定。结果见表4。

表4 没食子酸的耐用性(稳定性)

2.4.4 线 性

将没食子酸对照品溶液稀释为0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL的系列标准工作液。结果表明，没食子酸在0～40 μg/mL范围内线性良好(r>0.9999)。

3 结 论

高效液相色谱法是中药材质量检测常用的方法，可以准确的评估药材的含量是否达标，从而保证药材质量。本文研究建立了叶下珠含量测定方法，实验处理方法简单便捷，回收率高，精密度、线性、稳定性均符合要求，可作为叶下珠药材质量标准含量测定的方法。