复方参蛭胶囊的质量标准研究*

向泽栋，孙 平，薛 晴，李 震，刘国飞，高 鹏，代 龙

(1 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2 山东禹泽药康产业技术研究院有限公司，山东 德州 251200；3 滨州医学院药学院，山东 烟台 264003)

复方参蛭方为人参、黄芪、红曲、陈皮、水蛭、地龙等组成的中药临床常用复方制剂，具有活血化瘀、化瘀通络的功效，临床上常用于颈动脉斑块的治疗，疗效确切。方中主要成分为人参皂苷类、黄芪甲苷、橙皮苷、洛伐他汀以及其他多糖类、活性肽类成分，是复方参蛭方具有良好疗效的指标性成分[1-4]。为将复方参蛭方开发为中药新药，使其能够服务于广大人民群体，发挥中医药治疗优势，本研究前期在临床常用方基础上，采取多种提取工艺对成分进行提取，将传统临床复方制备成现代胶囊剂。为保障复方参蛭胶囊质量的可控性、稳定性和均一性，满足临床用药安全需求，本研究在《中国药典》2020版一部药材项下相关方法结合文献方法基础上[5-8]，利用薄层色谱法鉴别了制剂中人参、黄芪、红曲和陈皮等四味药材，采用高效液相色谱法建立制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量测定方法，为复方参蛭胶囊制剂的质量控制提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪 器

Shimadzu LC2030高效液相色谱仪，日本岛津公司；XS105DU电子分析天平(万分之一)，美国梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ2200DV型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-1800型紫外-可见光分光光度计，日本岛津公司；PHS-3C型pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；PK-S24型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；IKA VORTEX3旋涡混匀仪，广州仪科实验室技术有限公司。

1.2 药品与试剂

人参皂苷Rg1对照品(批号：110703-201832，纯度≥92.4%)、人参皂苷Re对照品(批号：110754-201827，纯度≥93.4%)、人参皂苷Rb1对照品(批号：110704-201726，纯度≥91.1%)、人参皂苷Rf对照品(批号：111719-201806)、黄芪甲苷对照品(批号：110781-201314)、橙皮苷对照品(批号：110721-201818)，均购自中国食品药品检定研究院。人参药材(批号：200501、200403、200405)、黄芪药材(200303、200502、200403)、红曲药材(200408、200403、200504)、陈皮药材(200203、200206、200306)、水蛭药材(200407、200302、200508)、地龙药材(200403、200506、200409)。甲醇、乙腈为色谱纯，美国TEDIA有限公司；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。HSG型薄层层析硅胶板，批号020200908，烟台江友硅胶开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 复方参蛭胶囊的制备

称取水蛭、地龙粉末(过50目筛)，加10倍水煮沸15 min，待冷却至40 ℃，以稀盐酸调至pH约1.5，加0.5%胃蛋白酶，于40 ℃保温酶解4 h，以20%氢氧化钠溶液调pH约8.0，加1.5%胰蛋白酶，于40 ℃保温酶解2 h，调节pH约7.0，于85 ℃水浴15 min杀酶，离心取上清液；取黄芪、陈皮加8倍量水浸泡45分钟后回流提取2次，每次1.5 h，滤过；取人参、红曲加8倍量70%乙醇浸泡1 h后回流提取2次，每次1.5 h，滤过。合并电渗析脱盐的酶解液与水提取液于(70±5) ℃左右减压浓缩，乙醇提取液于(70±5) ℃左右减压浓缩(真空度-0.08 MPa)至相对密度1.25～1.30(60 ℃)，合并浓缩液于(70±5) ℃左右真空干燥(真空度-0.08 MPa)，干浸膏粉碎成细粉(过65目筛)，加入微粉硅胶1.0 g，并加入微晶纤维素至总量为510 g，混合均匀，装入0号胶囊制成1000粒，装样量为0.51 g/粒，即得。

1.3.2 薄层鉴别

(1)人参供试品溶液的制备

取本品内容物1 g，置具塞锥形瓶中，加水1 mL润湿，加水饱和正丁醇20 mL，超声处理30 min，吸取上清液加30 mL氨试液洗涤2次，放置分层取上层液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。另取人参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf及人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的混合溶液，作为对照品溶液。按制剂的处方和工艺制备缺人参的阴性样品，按同法制备缺人参阴性对照溶液。

(2)黄芪供试品溶液的制备

取本品内容物2 g，置具塞锥形瓶中，加水20 mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇层，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次50 mL，合并正丁醇液蒸干，残渣加水20 mL溶解，通过D101大孔吸附树脂，先后以用 2 倍柱体积水，2倍柱体积 40%乙醇溶液，弃去洗脱液，收集3倍柱体积70%乙醇溶液的洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含黄芪甲苷0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按制剂的处方和工艺制备缺黄芪的阴性样品，按同法制备缺黄芪阴性对照溶液。

(3)红曲供试品溶液的制备

取本品内容物1 g，置具塞锥形瓶中，加75%乙醇10 mL，超声处理30 min，离心，取上清液作为供试品溶液。另取洛伐他汀对照品加75%乙醇制成每1 mL含洛伐他汀0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按制剂的处方和工艺制备缺黄芪的阴性样品，按同法制备缺红曲阴性对照溶液。

(4)陈皮供试品溶液的制备

取本品内容物1 g，置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)80 mL，加热回流4～5 h，弃去石油醚，挥干药渣，加甲醇20 mL超声30 min，滤过，取滤液浓缩至2 mL作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。按制剂的处方和工艺制备缺陈皮的阴性样品，按同法制备缺陈皮阴性对照溶液。

1.3.3 含量测定

对照品溶液制备：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合溶液，摇匀，即得。

供试品溶液制备：取本品内容物约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，密塞放置过夜，超声处理(250 W，40 kHz)30 min，滤过，精密移取续滤液25 mL，加入氨试液洗涤2次，每次25 mL，取正丁醇层，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液：按复方参蛭胶囊的处方和工艺制备缺人参的样品，再按供试品溶液制备方法制成缺人参的阴性对照溶液。

色谱条件：COSMOSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流速1 mL/min；柱温30 ℃；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～35 min, 19%A; 35～55 min, 19%～29%A; 55～50 min, 29%A; 70～100 min, 29%～40%A。

2 结果与讨论

2.1 薄层鉴别

2.1.1 人 参

照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验[9]，吸取上述人参供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)在10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰(图1)。

图1 复方参蛭胶囊中人参的TLC鉴别

2.1.2 黄 芪

照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取黄芪供试品溶液、黄芪甲苷对照品溶液、阴性对照溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(10:1:1:1)为展开剂展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点清晰，分别于日光和紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，日光下显相同的棕褐色斑点；紫外光灯(365 nm)下显相同的荧光斑点，阴性样品无干扰(图2)。

图2 复方参蛭胶囊中黄芪的TLC鉴别

2.1.3 红 曲

照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取红曲供试品溶液、洛伐他汀对照品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮(4:1)为展开剂展开，取出晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰(图3)。

图3 复方参蛭胶囊中红曲的TLC鉴别

2.1.4 陈 皮

照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取陈皮供试品溶液、橙皮苷对照品溶液、阴性对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17:13)为展开剂，展至约3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂，展至约8 cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰(图4)。

图4 复方参蛭胶囊中陈皮的TLC鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 专属性试验

分别吸取供试品、对照品、阴性对照溶液各10 μL进行测定。结果见图5～图7，供试品色谱图中，在与对照品色谱峰相同保留时间处有色谱峰出现，阴性色谱图中，在与对照品色谱峰相同保留时间无色谱峰出现，因此缺人参阴性样品无干扰，表明该方法专属性好。

图5 人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品溶液色谱图

图6 复方参蛭胶囊供试品溶液色谱图

图7 复方参蛭胶囊人参阴性溶液色谱图

2.2.2 精密度试验

取同一对照品溶液连续进样6次，进样量为10 μL，记录峰面积并计算RSD。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.76%、0.64%、0.76%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 线性与范围

表1 3种人参皂苷线性回归方程与线性范围

精密称取人参皂苷Rg113.51 mg、人参皂苷Re 12.64 mg、人参皂苷Rb113.96 mg对照品，置25 mL量瓶中加入甲醇至刻度，摇匀，得人参皂苷Rg10.4993 mg/mL、人参皂苷Re 0.4722 mg/mL、人参皂苷Rb10.5087 mg/mL的混合对照品溶液。精密吸取1、2、4、8 mL对照品溶液于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得到不同浓度的对照品溶液，与母液分别注入液相色谱仪各10 μL进行测定，以3个成分的质量浓度 (X, mg/mL) 为横坐标，相应峰面积 (Y) 为纵坐标进行线性回归，得到3个成分的线性回归方程和线性范围，结果见表1。结果表明3种人参皂苷在进样质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.2.4 稳定性试验

精密吸取供试品溶液适量，分别于室温下放置0、4、8、12、16、24 h时进样测定，记录峰面积并计算RSD。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.58%、0.53%、0.74% (n=6)，表明方法的稳定性良好。

2.2.5 重复性试验

精密称取复方参蛭胶囊内容物6份，每份称取约1g，精密称定，按“1.3.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品中3种人参皂苷的含量。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的平均含量分别为1.4682、1.2648、1.7859 mg/g，RSD分别为0.45%、0.44%、0.54% (n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率

精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，加水饱和正丁醇配制为每1 mL含人参皂苷Rg10.7337 mg、人参皂苷Re 0.6359 mg、人参皂苷Rb10.8935 mg的混合对照品溶液25 mL。分别精密吸取4、5、6 mL混合对照品溶液于250 mL量瓶中，加入水饱和正丁醇至刻度，备用。取已知含量的样品约0.5 g共9份，精密称定，置于锥形瓶中，按取样含量的80%、100%、120%精密加入混合对照品溶液，每组平行测定3次，按“1.3.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积并计算加样回收率。

表2 人参皂苷Rg1 、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1加样回收率试验

2.2.7 样品测定

取3批样品，按“1.3.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品中3种人参皂苷的含量，3批药材制备的复方参蛭胶囊样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量见表3。

表3 三批样品中人参皂苷Rg1 、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量

3 结 论

在人参含量测定的方法学考察试验中，前期采用药典《中国药典》2020版一部人参药材项下含量测定提取方法，发现方中其他成分带来的杂质对人参皂苷Rb1分离的影响较大，因此选择用氨溶液洗涤水饱和正丁醇提取液，除去部分酸性杂质，人参皂苷Rb1得到较好分离，达到含量测定的要求。同时本研究还考察了人参含量测定色谱条件的耐用性，发现温度(25、30、35 ℃)和流速(0.8、1、1.2 mL/min)的改变对3种人参皂苷的分离度均无显著影响，因此本研究建立的制剂中人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量测定方法的耐用性好，可行度高。

本研究前期优选了复方参蛭胶囊的制备工艺，得到胶囊剂成品，以此为基础建立了质量标准，有效的控制药品质量。本研究依据《中国药典》2020版一部药材项下相关方法结合文献方法，建立了鉴别制剂中人参、黄芪、红曲、陈皮的薄层方法，得到的薄层色谱图斑点清晰，专属性强，无阴性干扰，能较好的对复方参蛭胶囊制剂进行定性鉴别。本研究依据《中国药典》2020版一部人参药材项下含量测定的方法及相关文献，建立了制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的HPLC含量测定方法，操作简便，结果准确可靠，可以对复方参蛭胶囊制剂进行有效定量控制。