超高效液相色谱-串联质谱法测定空气中的丙烯酰胺

沈 权，胡凌霄,杜宇峰,朱丽波,陈 凯,冯加永

(1 宁波市奉化区环境保护监测站，浙江 宁波 315142；2 浙江省宁波生态环境监测中心，浙江 宁波 315142)

丙烯酰胺是由丙烯腈水化反应生成的无色透明晶体，分子结构简式为CH2=CHCONH2。丙烯酰胺熔点84.5 ℃，沸点为125 ℃，极易溶于水、丙酮和乙醇。丙烯酰胺是重要的工业原料，是生成聚丙烯酰胺的中间产物。丙烯酰胺具有致癌、致畸、致突变的三致效应，而且丙烯酰胺蒸汽能够通过皮肤、黏膜、呼吸道和消化道吸收，引起神经系统损伤和肝损伤，同时造成皮肤、眼睛等的腐蚀性损伤[1]。2002年，研究发现谷类、土豆、花生等食物经过高温处理(烹饪、油炸、烘烤)过程会产生丙烯酰胺，它除了通过食用途径对人类产生危害之外，在烹饪过程中随着油烟等直接挥发也会进入到厨师的呼吸道，因此丙烯酰胺是食品安全领域重要的研究对象[2-3]。工业生产过程中，丙烯酰胺在高温高压条件下以蒸汽或者结合水蒸汽的形式在空气中扩散，沿风向扩散距离可达数公里。我国工业场所空气中丙烯酰胺的8 h时间加权容许浓度(PC-TWA)为0.3 mg/mL。

常用的检测丙烯酰胺的方法有气相色谱法[4]、气相色谱质谱法[5]、高效液相色谱法[6]、高效液相色谱质谱法[7]等。丙烯酰胺属于热不稳定性物质，采用气相色谱法检测时常常需要使用衍生方法提高其稳定性，常用的衍生方法有溴化衍生法、2-巯基苯甲酸衍生法[8]等，衍生之后用电子捕获检测器(ECD)、氢火焰检测器(FID)或者质谱检测器(MS)检测。高效液相色谱法-紫外检测器检测丙烯酰胺无需衍生化，但是紫外检测器作为广谱性检测器选择性不够，容易出现假阳性。

本文建立了一种水吸收-超高效液相色谱-串联质谱法检测空气中丙烯酰胺的方法，空气样品采用水吸收的方法采集，过滤后直接进入超高效液相色谱-串联质谱检测，具有前处理简单、方法快速、准确度高等特点，适用于污染区域空气中丙烯酰胺的检测。

1 实 验

1.1 仪器、试剂、材料

Acquity UPLC色谱仪，美国Waters 公司，采用的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；Quattro Premier XE三重四级杆质谱仪，美国Waters 公司；小流量空气采样器，山东青岛崂应有限公司(流速范围为0.1～1.0 mL/min；Acquity)UPLC系统，美国Waters 公司；Quattro Premier XE三重四级杆质谱，美国Waters 公司。

一次性使用无菌注射器(1 mL)，浙江玉升医疗器械有限公司；水相针式滤器(13 mm×0.2 μm)，上海安谱科学仪器有限公司；多孔波板吸收管(100 mL)，浙江星云玻璃仪器生产公司；所有玻璃容器使用前均经过清水清洗3次，甲醇、乙腈分别清洗3遍以上，再用去离子水清洗3遍以上，烘干待用。

丙烯酰胺固体标样(99.5%，优级纯)，国药集团；色谱纯乙腈、甲酸，美国TEDIA公司；色谱纯甲酸，美国Fisher Scientific公司；Mill-QG去离子水 (18.3 MΩ)，美国Millipore公司。

丙烯酰胺标准溶液：用甲醇/水为7:3的溶剂标准配置1 μg/mL的丙烯酰胺储备液备用。然后用7:3的甲醇/水溶剂配置5个浓度标准的(1.0，5.0，10.0，50.0，100 μg/L)标准曲线待用，在4 ℃条件下避光保存，一个月内有效。

1.2 样品采集、前处理

样品采集自宁波市镇海区某丙烯酰胺生产厂附近，该区域有两家丙烯酰胺年产量在10万吨以上的生产厂，占全国生产量30%以上。15个采样点分别位于厂区内、厂区外50 m、100 m、500 m、1 km附近，选取了四个方向作为比对。

空气样品用一个内装50.0 mL纯水的多孔玻板吸收管以0.5 L/min流量、采气45 min取得。记录采样时的温度和大气压力及采样体积。采样后，密封采样玻璃管。采样时应采集全程序空白。采集后应尽快分析。如不能及时分析，应在4 ℃条件下避光保存，不超过7天。

样品运回实验室后采用一次性进样针吸入约1 mL样品,经过0.2 μm的水相针式滤器过滤后直接注入液相进样小瓶中待测。

1.3 色谱方法

采用梯度洗脱的方式，流动相流速为0.2 mL/min，柱温为40 ℃，进样体积为10 μL，流动相梯度见表1。其中，A相为甲醇，B相为0.1%甲酸/水溶液。

表1 流动相梯度

1.4 质谱方法

为保证在最优条件下进行条件优化，采用流动注射模式(Flow Injection Analysis，FIA)进行质谱条件的优化。Q1全扫描范围为60～80 m/z，单位分辨率扫描时间为0.2 s。实验中最终采用的电离模式为ESI正离子模式，最终电离条件如表2。MRM模式中采用的碰撞能量为10 eV，定量反应通道为72～55 m/z，定性反应通道为72～44 m/z,单个反应通道扫描时间为0.2 s(表2)。

表2 质谱条件

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

丙烯酰胺的水溶性和极性较强，而且分子量较小，在普通反相色谱柱中保留较弱，峰形拖尾严重。HILIC色谱柱是近年来用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质的色谱柱类型，用反相色谱的形式来完成正相色谱的工作。HILIC色谱柱固定相为强极性，需要配合高比例有机相的流动相，而有机相比例的提高有利于提高电喷雾的挥发性，从而提高了质谱的灵敏度。本实验对C18色谱柱和HILIC色谱柱进行了对比，丙烯酰胺在C18色谱柱中保留困难，而且稳定性和重复性不好，而丙烯酰胺在HILIC色谱柱中峰形较好。

在溶剂匹配试验中，丙烯酰胺在乙腈/0.1%甲酸溶液流动相中与甲醇/0.1%甲酸溶液相比，分离度差距不大，但是甲醇更适用于HILIC色谱柱，对应的质谱灵敏度更高，实验中采用了甲醇/0.1%甲酸作为流动相。

图1 丙烯酰胺总离子流色谱图

2.2 质谱条件优化

表3 质谱反应通道

为了更符合实际模式，单质谱模式下，以1.0 ug/mL的丙烯酰胺为毛细管流动注射模式进行质谱条件优化，流动相条件为7:3的甲醇/0.1%甲酸水溶液。首先通过ESI/APCI的比较，SIM模式下发现ESI中丙烯酰胺的灵敏度明显好于APCI，这与ESI更适用于极性物质的结论相符。在ESI正离子模式中，SIM模式下发现质荷比为72的分子离子响应较强，碰撞能量超过20 eV时丙烯酰胺碎片很多且均不是很强，说明丙烯酰胺分子并不是很稳定。在10 eV情况下72-55反应通道最强，作为定量通道；72-44为次要通道，作为定性通道 。MS优化参数中，影响最大的为锥孔电压，其中20～30 V为最佳优化区间，40 V以上信号消失，最终优化值为25 V，其他参数影响不明显。

2.3 前处理优化

一般工作场所中常用的丙烯酰胺采样方法为硅胶管采样法，这种方法要采用一次性的硅胶管来采集空气中的丙烯酰胺。它最大的弊端是存在前端要不要采用脱脂棉脱水的问题：如果脱水，丙烯酰胺会随水蒸气一起被脱脂棉聚留，如果不脱水则会导致水分进入采样管导致堵塞，在实际实验中操作起来较困难。本实验采用水吸收法来采集空气中的丙烯酰胺，串联两根U型管以检测该方法的穿透率，当空气中丙烯酰胺浓度为0.39～1.54 mg/m3时，采样效率达到97.5%～100%，因此水吸收法可以用于空气中丙烯酰胺的采集且方法更简单、方便和快捷。

2.4 检出限、测定下限和线性范围

按照《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168-2010)的相关规定，连续分析7个接近于检出限浓度的实验室空白加标样品，计算其标准偏差S。用公式：MDL=St(n-1，0.99)(连续分析7个样品，在99%的置信区间，t(6，0.99=3.14))进行计算。其中：t(n-1，0.99)为置信度为99%、自由度为n-1时的t值；n为重复分析的样品数。测定下限为4倍检出限。丙烯酰胺在水中的方法检出限分别为0.5 μg/L，对应的空气中的方法检出限为1.11 μg/m3，测定下限为4.44 μg/m3，能够满足实际环境监测的需要。在水中浓度1.0～3000 μg/L范围内，对应空气中浓度范围为相关系数(R2)范围为0.9995，线性方程为y=240.3x+227.8，线性良好。

2.5 准确度和精密度

实验室空白和方法空白均没有丙烯酰胺检出。仪器和方法的稳定性通过5天内每日重复取两种浓度(10.0 μg/L，100 μg/L)5个空白样品加标样来验证，次偏差(run to run)为4.9%～9.7%，日偏差(day to day)为6.1%～13.2%。用实际样品进行10.0、100、1000 μg/L低中高三个浓度加标，采用加标回收率评价方法准确度，采用日内标准偏差和日间标准偏差来评价方法的精密度。日内标准偏差为同日内按照样品分析的全部步骤平行测定6份同样浓度加标样品中目标物的浓度计算其相对标准偏差，日间标准偏差为连续6日每日测定同样浓度加标样品中目标物的浓度计算其相对标准偏差。对于10～1000 μg/L浓度范围的加标水样进行精密度实验，日内标准偏差为3.9%～8.7%，日间标准偏差为6.5%～17.5%，符合空气分析中一般低于30%的要求。按本方法确定的分析测定条件及步骤，选取实际样品进行三种不同浓度(10.0、100、1000 μg/L)的加标实验，回收率范围在81.1%～87.4%。说明本方法的准确可靠。

2.6 实际样品检测

在15个实际样品的检测之中，丙烯酰胺的检出浓度范围为ND-1.54 mg/m3。从检测数据来看，丙烯酰胺在厂区周围内污染较为严重，其污染情况受风向和距离的影响较大。

表3 空气中丙烯酰胺的含量

3 结 论

本文建立了水吸收-UPLC-MS/MS的方法检测空气中的丙烯酰胺，与常规的硅胶管吸附-气相色谱法检测方法相比，该方法避免了复杂的前处理和衍生过程，节约了试剂和时间，同时保证了足够的灵敏度，适用于空气中丙烯酰胺的检测。