西兰花种子中萝卜硫素酶解浸提工艺研究

谢述琼，何　珺, 舒　华

(1 贵州理工学院，贵州　贵阳　550025；2 贵州省生化工程中心，贵州　贵阳　550025;3 贵州城市职业学院，贵州　贵阳　550025)



西兰花种子中萝卜硫素酶解浸提工艺研究

谢述琼1，何珺2, 舒华3

(1 贵州理工学院，贵州贵阳550025；2 贵州省生化工程中心，贵州贵阳550025;3 贵州城市职业学院，贵州贵阳550025)

西兰花中含有丰富的抗癌物质，对大多数癌症都有较强的作用。本文研究了从西兰花种子中酶解浸提萝卜硫素的工艺，确定其最佳的酶解浸提参数。通过单因素梯度实验研究，采用自身芥子苷酶酶解以及密封浸提方式提取西兰花种子中萝卜硫素，主要对酶解时间，酶解料液比，酶解pH，超声浸提乙醇浓度，超声浸提时间，超声浸提次数几种浸提参数进行研究。结果表明: 西兰花种子中萝卜硫素酶解浸提最佳条件为：酶解时间为8 h以上，酶解料液比为1:2，酶解pH为7，超声浸提溶剂为80%乙醇，超声浸提时间为30 min，超声浸提的次数为2次。西兰花种子中萝卜硫素的酶解浸提工艺参数达到最佳时，其提取率可以大大的提高。

西兰花种子；萝卜硫素；酶解浸提工艺

西兰花中含有的丰富的抗癌物质能够减低肿瘤的形成，阻止致癌物质的活动[1]。英国科学家1997年初的一次抗癌蔬菜研究结果表明，西兰花含有十分丰富的葡萄糖异硫代氰酸盐类的辅助化合物[2]。美国约翰霍普金斯大学医学院的Brassica Chemooprotection实验室发现西兰花含有大量的异硫代氰酸盐，并且这些异硫代氰酸盐可激活人体自身的抗癌物质Phase Two Enzymes[3]。西兰花中硫代葡萄糖苷含量非常丰富，其中含量最高的是萝卜硫素[4]。萝卜硫素又称莱菔子素，是活力最强的一类异硫氰酸盐。它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌治疗中得到证实[5],近5年来，国内外学者研究发现蔬菜中存在的一些化合物具有抗癌活性，尤其是富含胡萝卜素的蔬菜，如：胡萝卜、西兰花、花椰菜和菠菜等[6-8]。

萝卜硫素的高提取率对萝卜硫素的进一步研究具有重要的意义，本课题以西兰花种子为原料，研究了萝卜硫素酶解浸提工艺，初步探明萝卜硫素的较优酶解提取工艺参数，为萝卜硫素的酶解浸提研究提供参考。

1　实　验

1.1仪器

分析型HPLC：Agilent Technology(1100series),US,C18高效液相色谱柱，大连依利特分析仪器有限公司；BSA124S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；HH.SY21-Ni6电热恒温水浴锅，北京长源实验设备厂；SG2200HE超声波清洗器，上海冠特超声仪器公司；FW80粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；其他为一般常规仪器。

1.2样品与试剂

样品：西兰花种子，购自上海市闵行区，采集于2011年3-5月。

试药：萝卜硫素对照品(S-4441；纯度≥90%)，sigma公司；甲醇、乙醇、丙酮(AR)，天津科密欧化学试剂厂；纯化水，贵州省生化工程中心制备。

1.3萝卜硫素测定

1.3.1色谱条件

色谱柱: Hypersil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；检测器：紫外检测仪；波长：201 nm；灵敏度：0.04 AUFS；柱温：35 ℃；进样体积：10 μL；流动相：甲醇-水(20:80)。

1.3.2对照品溶液制备

准确称取萝卜硫素5 mg于25 mL量瓶中，加入甲醇超声溶解,并定容至刻度，备用。

1.4萝卜硫素含量测定公式

萝卜硫素含量(mg/g)=0.2(mg/mL)×90%×A样×

样品体积(mL)/[A标×样品质量(g)]

式中：A样——样品峰面积

A标——标样峰面积

2　结果与讨论

2.1酶解与不酶解对萝卜硫素含量的影响

分别精密称取1 g西兰花种子6份，平行取样3次，利用粉碎机粉碎成均匀粒度大小适中的粉末，置于试管中，酶解：用2 mL纯化水溶液润湿，分别置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超声提取30 min(2次)；不酶解：直接加乙醇10 mL超声提取30 min(2次),微滤，所得滤液采用HPLC测定，按照1.4的公式计算浸提液中萝卜硫素的含量。结果见表1。

表1　西兰花种子酶解与不酶解条件下萝卜硫素 含量结果(n=3)Table 1　Sulforaphane Content of broccoli seeds with enzyme and not- enzyme (n=3)

从表1可知，酶解对于萝卜硫素的提取非常重要，在不酶解的情况下，萝卜硫素的含量几乎为0，所以萝卜硫素的提取前必须先酶解，于是对其酶解条件进行了以下的研究。

2.2酶解时间选择

图1　酶解时间对萝卜硫素含量的影响Fig.1　The influence of sulforaphane content with enzymolysis time

分别精密称取1 g西兰花种子15份，平行取样3次，粉碎机粉碎成均匀粒度大小适中的粉末，置于试管中，用2 mL 纯化水溶液润湿，分别置于35 ℃水浴酶解2、4、6、8、10、12 h，再加乙醇定容至10 mL，超声0.5 h(10 min/次，分3次超声)提取，微滤，所得滤液采用HPLC测定，按照1.4的公式计算浸提液中萝卜硫素的含量。结果见图1。

从图1可知，随着酶解时间的加长，萝卜硫素的含量逐渐在增加，到酶解8 h时，萝卜硫素的含量达到最大为6.682 mg/g，之后再增加酶解时间对萝卜硫素的含量影响不大，因此，确定最佳浸提时间为8 h。

2.3酶解料液比选择

分别精密称取1g西兰花种子15份，平行取样3次，粉碎机粉碎成均匀粒度大小适中的粉末，置于试管中，分别用1，2，3，4，5 mL(料液比分别为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5)的纯化水，于35 ℃下水浴酶解8 h，再分别加4、8、12、16、20 mL乙醇使得乙醇浓度保持在80%，超声0.5 h(10 min/次，分3次超声)提取，微滤，所得滤液采用HPLC测定，按照1.4的公式计算浸提液中萝卜硫素的含量。结果见图2。

图2　酶解料液比对萝卜硫素含量的影响Fig.2　The influence of sulforaphane content with enzymolysis liquid ratio

从图2可知，西兰花种子中萝卜硫素的含量在酶解料液比为1:1时最低，为1:2时最高，随着料液比的增大，萝卜硫素的含量略有降低，影响不明显。综合考虑成本，后续浓缩操作等，确定酶解时的最佳料液比为1:2。

2.4酶解液pH选择

分别精密称取1 g西兰花种15份，平行取样3次，粉碎机粉碎成均匀粒度大小适中的粉末，置于试管中，用2 mL pH依次为3，5，7，9，11的纯化水溶解，于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超声半个小时(10 min/次，分3次超声)提取，微滤，所得滤液采用HPLC进行测定，按照1.4的公式计算浸提液中萝卜硫素的含量。结果见图3。

图3　酶解pH对萝卜硫素含量的影响Fig.3　The influence of sulforaphane content with enzymolysis pH

从图3可知，西兰花种子中萝卜硫素的含量在pH=7时最高。pH偏高或者偏低都会对西兰花种子中萝卜硫素的含量有明显的影响，随着pH的增大，萝卜硫素含量在逐渐升高，至pH=7时达到最大，之后随着pH的增大萝卜硫素的含量反而降低，可能是因为在酸或者碱性条件下影响酶的活性原因。因此，确定最佳酶解pH=7。

2.5超声浸提乙醇浓度选择

分别精密称取1 g西兰花种子15份，平行取样3次，粉碎机粉碎成均匀粒度大小适中的粉末，置于试管中，分别加入10 mL(料液比1:10)20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液，分别置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超声0.5 h(10 min/次，分3次超声)提取，微滤，所得滤液采用HPLC测定，按照1.4的公式计算浸提液中萝卜硫素的含量。结果见图4。

图4　浸提乙醇浓度对萝卜硫素含量的影响Fig.4　The influence of sulforaphane content with Extraction ethanol concentration

从图4可知，乙醇-水溶液浸提效果明显好于水，在80%以下浓度时乙醇浓度对浸提率的影响呈线性上升，80%乙醇提时提取最好，但当浸提溶剂醇浓度大于80%后萝卜硫素浸提稍减小，可能是因为温度高产生的影响。综合成本和提取率考虑，确定最佳浸提乙醇浓度为80%。

2.6超声浸提时间选择

分别精密称取1 g西兰花种子15份，平行取样3次，粉碎机粉碎成均匀粒度大小适中的粉末，置于试管中，用2 mL纯化水溶液润湿，分别置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，分别超声10、20、30、40、50 min提取，微滤，所得滤液采用HPLC测定，按照1.4的公式计算浸提液中萝卜硫素的含量。结果见图5。

图5　浸提时间对萝卜硫素含量的影响Fig.5　The influence of sulforaphane content with Extraction time

从图5可以看出，在30 min前萝卜硫素含量随时间升高而升高，而后随时间的升高，萝卜硫素含量有所降低。综合考虑各方面因素，最佳浸提时间为30 min。

2.7超声浸提次数选择

精密称取1 g西兰花种子3份，平行取样3次，利用粉碎机粉碎成均匀粒度大小适中的粉末，置于试管中，用2 mL纯化水溶液润湿，分别置于35 ℃水浴酶解8 h，再加乙醇定容至10 mL，超声提取30 min，微滤，将滤渣继续加10 mL 80%乙醇提取30 min,微滤，重复上述操作3次，分别将所得滤液采用HPLC测定，按照1.4的公式计算浸提液中萝卜硫素的含量。结果见图6。

图6　浸提次数对萝卜硫素含量的影响Fig.6　The influence of sulforaphane content with Extraction times

从图6可以看出，第1、2次超声浸提的萝卜硫素含量较高，第3次开始含量很低了，考虑成本的需要，建议采取超声提取2次。

3　结　论

(1)本实验通过单因素梯度实验研究西兰花种子中萝卜硫素的提取工艺参数，主要对萝卜硫素提取时的是否酶解，酶解时间，酶解料液比，酶解液pH，超声浸提乙醇浓度，超声浸提时间、超声浸提次数几种酶解浸提参数进行研究，结果表明，西兰花种子中萝卜硫素最佳酶解浸提条件为：萝卜硫素的提取必须进行酶解，酶解时间为8 h，此时萝卜硫素的含量达到最大为6.682 mg/g，再增加酶解时间对萝卜硫素的含量影响不大；酶解料液比为1:2，此时含量最高，随着料液比的增大，萝卜硫素的含量略有降低；酶解浸提pH为7，pH偏高或者偏低都会对西兰花种子中萝卜硫素的含量有明显的影响；超声浸提溶剂为80%乙醇最好；超声浸提时间为30 min，在30 min 前萝卜硫素含量随时间升高而升高，而后随时间的升高含量有所降低；超声浸提的次数为2次。

(2)本实验对西兰花种子中萝卜硫素的酶解及其超声浸提参数进行了筛选,但是因萝卜硫素对温度稳定性不好,在浸提后的溶液贮存及其加工过程中一定要冷冻存放,且对超声浸提溶剂选择乙醇是因大生产中该溶剂相比丙酮更易采购,且在生产中比甲醇更无毒更安全，因此研究结果对提取西兰花中子中萝卜硫素提取提供参考,并为开发利用西兰花种子中萝卜硫素打下一定基础。

(3)本实验最为重要的一点是西兰花种子中萝卜硫素的提取必须要先经过酶解的过程，也有研究者添加其他酶让其酶解，但是成本较高，经过本实验的探索，其实其自身的酶足以让其酶解，所以可以采取自身酶来酶解，以降低成本。

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Leaching Process Research of Sulforaphane with Broccoli Seeds

XIEShu-qiong1,HEJun2，SHUHua3

(1 Guizhou Normal College, Guizhou Guiyang 550025;2 Guizhou Institute of Technology, Guizhou Guiyang 550025;3 Zuizhou City Vocational College, Guizhou Guiyang 550025, China)

Broccoli contains abundant anti-cancer substances, for most cancer it has a stronger effect. This experiment studied Enzyme solution leaching process of sulforaphane in broccoli seeds, determining the optimum enzymic extraction parameters. Through the single factor gradient experiment research, using own mustard glucoside enzyme digestion and seal extraction method to extract sulforaphane in broccoli seeds, enzymatic hydrolysis time, solid-liquid ratio, acidity leaching, extraction of ethanol concentration, extraction time and ultrasonic extraction times were mainly studied. Results showed that the optimum leaching conditions were as follows: enzymolysis time of 8 h, solid-liquid ratio of 1:2, leaching pH of 7, extraction solvent of 80% ethanol, extraction time for 30 min,the number of ultrasonic extraction of 2 times. The extraction parameter of sulforaphane gets to the best, its extraction efficiency can be greatly improved.

broccoli seeds; sulforaphane; enzyme solution leaching process

谢述琼，女，硕士，实验师。

何珺,女,副教授，硕士生导师。

O62

A

1001-9677(2016)08-0073-04