基于MMI 技术对印染废水中NP 降解关键功能菌群的识别、构建与评估

杨 庆，王 铸，许欣宇，黄开龙，，，王德朋，左怡琳，张徐祥

（1.南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，江苏南京 210023；2.广州大学大湾区环境研究院，珠江三角洲水质安全与保护教育部重点实验室，广东广州 510006；3.南京江岛环境科技研究院有限公司，江苏南京 210019）

壬基酚（NP）作为使用量大、污染范围广、生物累积性和内分泌干扰活性强的一类烷基酚物质，是最典型的烷基酚类内分泌干扰物，已被联合国环境保护署确定为优先控制污染物，同时也被欧盟列为13 种优先控制的有毒污染物之一〔1〕。近年来，NP 在湖泊、河流、地下水、土壤等环境介质中均有检出〔2〕。NP 是一种重要的精细化工原料和中间体，约70%用于生产非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚（NPEO，市场份额达80%以上〔3〕），环境中的NP 主要来源于NPEO 的降解〔4〕。在印染行业生产过程的漂白、炼煮、丝光等工序中需加入大量的染整助剂，NPEO 作为渗透剂、乳化剂、洗涤剂和分散剂被大量使用。我国每年约有6~7 亿t 印染废水排入受纳水体，由于NPEO 的大量使用，其降解产物NP 被大量外排，环境中的NP 严重威胁动植物的生长与安全。NP可导致鱼类急性致死效应〔5-6〕，抑制种子发芽和生长〔7〕，并可通过抑制雌激素与其受体的结合破坏哺乳动物激素系统的正常功能〔8-9〕。因此，对印染废水中NP的高效去除意义重大。

目前对于NP 的处理方法主要分为物理法、化学法与生物法〔10〕。生物法因成本低廉、去除率高且绿色环保，成为去除环境介质中NP 的一种快速有效的方法〔11〕。NP 去除的生物强化技术是生物法中应用最广泛的技术，其关键在于功能菌株的获取。传统生物筛选是通过以特定污染物作为选择培养基组分筛选获得高效菌株，再根据降解效率进行复配，因微生物不易观测、筛分及系统具有复杂性使得筛选与复配工作盲目性较高。生物分离及分子生物学技术的进步为微生物的识别与构建提供了有效手段。磁性纳米颗粒介导分离（MMI）技术是利用生物相容的磁性纳米颗粒（MNPs）使所有微生物具有磁性，活性微生物随着细胞分裂的进行，其表面的MNPs 逐渐脱落并最终失去磁性，通过外加磁场可将功能微生物从未分裂或不活跃且维持磁性的微生物群落中分离开来〔12〕。MMI 无需底物标记即可从复杂微生物系统分离具有活性的功能微生物或微生物菌群〔13〕，从微生物群落中有效分离具有污染物降解功能的微生物，从而有效提高目标微生物的相对丰度，是特定功能微生物分选富集的有力工具〔14〕。本研究基于MMI 技术对印染废水好氧污泥进行富集分离，结合分子生物学技术，识别并获得NP 降解的关键功能菌，并依据其相对丰度比例构建复合功能菌群，同时评估复合功能菌群对印染废水中NP 的降解效率和毒性削减效果，以期为印染废水中NP 的高效降解提供微生物种质资源，为印染废水中特征污染物的生物强化降解以及废水毒性的深度削减提供新的解决方案和技术思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 污泥来源

污泥采集自江苏省宜兴市3 个印染厂（ZX、YZ、WX）废水处理流程中好氧池的活性污泥。

1.1.2 试剂

聚烯丙基胺盐酸盐（PAAH），相对分子质量15 000~20 000，购自美国麦克林；壬基酚（Nonylphenol），优级纯，购自美国麦克林；酵母粉LP0021B、胰蛋白胨LP0042B，均购自英国Oxoid；化学试剂NH4Cl、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、CaCl2·2H2O、FeCl3、FeCl2等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

1）壬基酚选择培养基。

无机盐基础培养基：NH4Cl 2.5 g，KH2PO42.5 g，Na2HPO45 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnCl2·4H2O 0.02 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，蒸馏水1 000 mL，pH 在7.0~7.2之间，121 ℃高压灭菌20 min，备用。

无机盐-NP 液体筛选培养基：以无水乙醇为溶剂配制0.05 g/mL 的NP 溶液，用0.45 μm 滤膜过滤除菌后制备成NP-乙醇储备液；在无机盐基础培养基中加入灭菌后的NP-乙醇储备液，使培养基NP 质量浓度为200 mg/L。

选择性固体培养基：在无机盐基础培养基中加18 g琼脂，121 ℃高压灭菌后倒平板，在平板上喷洒100 μL NP-乙醇储备液并涂抹均匀，待乙醇挥发完毕后使用。

2）富集培养基。

LB 固体培养基：酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，琼脂20 g/L，pH 为7.0~7.5。

LB 液体培养基：酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 为7.0~7.5。

1.1.4 实际废水

采集江苏省宜兴市某印染厂废水处理工艺的好氧池进水，加入NP-乙醇储备液使废水中NP 质量浓度分别为1、200 mg/L。

1.2 实验方法

1.2.1 MNPs 的合成及功能化

采用改进后的化学沉淀法进行MNPs 的合成〔3，15〕。将2.0 mL 1 mol/L 的氯化铁和0.5 mL 2 mol/L的氯化亚铁水溶液混合并剧烈搅拌，之后滴加25 mL 2 mol/L 的氢氧化钠溶液，持续搅拌约30 min。用永磁体对反应溶液进行分离得到磁性纳米颗粒（MNPs）沉淀，弃去上清液，用与上清液等体积的去离子水重复洗涤分离，直至MNPs 溶液的pH 为7，获得MNPs 溶液。取5 mL 上述MNPs 溶液，将其加入到45 mL 10 g/L 的PAAH 溶液中，超声稳定60 min。然后放入离心机离心10 min，弃去上清液后将颗粒重悬在50 mL 去离子水中并涡旋分散，之后溶液经0.22 μm 滤膜过滤后得到功能化磁性纳米颗粒（PAAH-MNPs）。

1.2.2 基于MMI 技术的功能菌群富集

将采集获得的好氧污泥（ZX、YZ、WX 印染厂对应的污泥样品编号为ZXC-0、YZC-0、WXC-0）进行富集培养。污泥于4 000 r/min 转速下离心10 min，取离心后固体3 g 于干净的锥形瓶中，加入90 mL 过膜后的PAAH-MNPs 溶液，用涡旋振荡器使污泥均匀分布在PAAH-MNPs 溶液中，之后常温下将其置于摇床中以150 r/min 转速振荡20 min 后转移至干净的离心管中，用永磁体吸附沉淀，弃去上清液，加入与上清液等体积的无菌水洗涤，再次在4 000 r/min 转速下离心10 min，弃去上清液，将离心后固体转移至锥形瓶中。向锥形瓶中加入NP-乙醇溶液，使混合液中NP 质量浓度为50 mg/L，于28 ℃置于摇床中以150 r/min 转速驯化一周。驯化结束后用永磁体分离，取5 mL 分离后的悬浊液用无水乙醇按1∶1 体积比保存用于DNA 提取（ZX、YZ、WX 印染厂污泥对应的功能菌培养后样品编号为ZXC-50、YZC-50、WXC-50），剩余悬浊液重新功能化培养，提升NP 驯化质量浓度至200 mg/L，置于摇床中于28 ℃、150 r/min 条件下驯化一周，之后取5 mL 分离后的悬浊液用无水乙醇按1∶1 体积比保存同样用于DNA 提取（ZX、YZ、WX 印染厂污泥对应的功能菌培养后样品编号为ZXC-200、YZC-200、WXC-200），剩余悬浊液用于NP 降解菌株的筛选。

1.2.3 16S rRNA 高通量测序和微生物群落结构分析

分别采集驯化前及驯化过程中的污泥样本，运用DNA 提取试剂盒（FastDNA®Spin Kit，MP Biomedicals，美国）提取活性污泥的总DNA。将上述获得的DNA 样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rRNA（V3~V4 区）高通量测序。选取0.97的相似度阈值进行OTUs 划分，最后利用RDP Classifier 算法，通过比对Greengenes 数据库进行物种分类信息注释〔16-17〕。基于OTUs 水平的数据，采用Bray-Curtis 算法进行主坐标分析（PCoA），评估每个样本物种组成的相似性。

1.2.4 NP 降解菌的筛选、鉴定及功能菌群构建

分别取不同印染厂驯化完成的好氧污泥悬浊液1 mL，将悬浊液稀释至浓度为原浓度的10-1、10-2、10-3、10-4，取100 μL 稀释液按浓度梯度从低到高均匀涂布到NP 筛选培养平板中，放于生化培养箱内于28 ℃倒置培养3~5 d。挑取颜色、形态、大小不同的单菌落，于LB 固体培养基上划线培养，多次划线培养至获得单一菌落，观察LB 培养基上菌落形态，利用革兰氏染色法〔18〕进行初步鉴定，并于LB 斜面上划线保存。然后将获得的所有单一菌株通过16S rDNA技术进行分子鉴定，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。将所获序列在NCBI 数据库中进行BLAST 搜索同源序列比对，运用MEGA 软件中Neighbor-Joining 方法构建系统发育树，确定细菌种属〔19〕。将纯化识别得到的单菌株接种于液体LB 培养基中，在28 ℃、150 r/min 转速下避光振荡培养。取吸光度（OD600）为1.0 的菌液，按V菌液∶V培养基=1∶10 接种至无机盐-壬基酚选择培养基中培养7 d，每天取样，样品过0.45 μm 滤膜，通过高效液相色谱法检测培养过程中NP 浓度，计算NP 降解率〔20〕。

将筛选鉴定的微生物种属与基于群落结构分析得到的NP 降解功能种属进行比对，选择识别获得的关键功能菌属并参考其相对丰度进行复配，构建基于MMI 技术识别的NP 降解关键功能菌群。构建过程如下：将筛选识别的NP 降解功能菌分别接种于液体LB 培养基中，于28 ℃、150 r/min 条件下避光振荡培养至菌液吸光度（OD600）为1.0。以识别得到的各功能菌属的相对丰度比为体积比，取不同种类单菌菌液混合均匀得到菌母液。按V菌母液∶V培养基=1∶10 接种菌母液至无机盐-壬基酚选择培养基中培养7 d，每天取样，样品过0.45 μm 滤膜后测定NP 浓度。

1.2.5 响应面法优化复合功能菌群降解NP 的条件

通过单因素实验确定对NP 降解关键功能菌群影响显著的因素，包括初始pH、温度、摇床转速的取值范围，进而确定正交实验因素及水平范围（表1）。然后利用Design Expert 软件，以pH（A）、温度（B）、摇床转速（C）3 个因素为自变量，以NP 降解率为响应值，按Box-Behnken Design（BBD）原理设计响应面实验〔21〕。根据软件输出的实验组条件，以V菌母液∶V培养基=1∶10 接种复合菌群菌母液至无机盐-壬基酚选择培养基中培养7 d取样，样品过0.45 μm 滤膜后测定NP 浓度，计算NP 降解率。将响应值输入实验设计表后，分析最终优化结果。在最优条件下，测定复合菌群的生长量（吸光度OD600值）与NP 降解率。

表1 复合菌群响应面优化因素水平设计表Table 1 Response surface optimization factor level design table of complex flora

1.2.6 复合功能菌群对实际废水中NP 的降解动力学研究

将复合菌群的菌母液按V菌母液∶V培养基=1∶10 的接种量接种至实际废水中，在最优降解条件下培养，定时（0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）取样测定NP 浓度，利用零级动力学模型和一级动力学模型对降解数据进行拟合。

1.2.7 复合功能菌群对实际废水毒性削减研究

毒性实验设置对照组（不加菌）和处理组（投加复合菌剂）。在最优降解条件下采用复合功能菌群处理NP 初始质量浓度分别为1、200 mg/L 的实际废水，分别采集处理过程中不同时间段的反应液3 mL，经0.45 μm 滤膜过滤得到滤液，作为毒性实验样品。发光细菌急性毒性和类雌激素效应分别采用国家标准《水质急性毒性测定 发光细菌法》（GB/T 15441—1995）的优化方法〔22〕和重组酵母Saccharomyces cerevisiae BLYES 培养法〔23〕测定。

2 结果与讨论

2.1 基于MMI 技术对NP 降解功能菌群的识别

对3 个印染厂废水处理工艺好氧段活性污泥经MMI 富集分离的样品进行PCoA 分析，结果见图1。

图1 基于MMI 富集分离污泥样品的PCoA 分析Fig. 1 PCoA analysis of sludge samples based on MMI enrichment and isolation

由图1 可知，初始活性污泥样本中ZXC-0 与另外两个厂区的微生物结构差异较大，这可能是由于工艺差别所致，ZX 处理工艺为单一“好氧处理”，而YZ 与WX 处理工艺为“厌氧-好氧”组合工艺。经MMI 富集驯化后，来源不同的种泥中微生物群落结构趋于相似，且随着NP 驯化浓度的增加，样本间微生物群落结构相似度逐渐升高。

对不同印染厂废水处理工艺好氧活性污泥在MMI富集过程中群落结构的变化进行分析，结果见图2。

图2 基于MMI 富集分离的微生物群落结构及优势种属Fig. 2 Microbial community structure and dominant species analysis based on MMI enrichment and isolation

由图2（a）可知，初始活性污泥ZXC-0、YZC-0、WXC-0 优势菌门分别为变形菌门（Proteobacteria，61.23%）、绿弯菌门（Chloroflexi，16.75%）、unclassified_Bacteria（9.25%）。随着NP 驯化浓度的增加，3 种污泥中变形菌门（Proteobacteria，61.23%~83.24%）、厚壁菌门（Firmicutes，0.62%~9.53%）与放线菌门（Actinobacteria，1.89%~3.02%）的平均相对丰度均上升，逐渐成为驯化体系中的优势菌门，最终总丰度超过90%。其中，变形菌门的平均相对丰度83.24%，表明其对NP具有较强的耐受性〔24〕。

由图2（b）可知，未驯化前污泥中优势菌目分别为嗜甲基菌目（Methylophilales，17.85%）、着色菌目（Chromatiales，15.66%）、红环菌目（Rhodocyclales，10.09%）、交替单胞菌目（Alteromonadales，9.05%）。随着NP 驯化浓度的增加，肠杆菌目（Enterobacteriales，0.53%~33.93%）、伯克氏菌目（Burkholderiales，3.38%~21.29%）、假单胞菌目（Pseudomonadales，1.04%~22.86%）、气单胞菌目（Aeromonadales，1.15%~8.23%）、梭菌目（Clostridiales，1.16%~10.67%）、放线菌目（Actinomycetales，0.57%~0.72%）、弯曲杆菌目（Campylobacterales，0.13%~0.58%）的相对丰度均有所增加，表明上述菌目可能与NP 的降解相关。

进一步解析上述菌目中相对丰度超过0.5%的属，结果如图2（c）所示，未驯化前的优势菌属为气单胞菌属（Aeromonas，13.41%）、unclassified_Actinobacteria（9.40%）、unclassified_Burkholderiales（8.85%）、Delftia（8.65%）等。随NP驯化浓度的增加，unclassified_Enterobacteriaceae（5.33%~30.17%）、假单胞菌属（Pseudomonas，6.53%~28.63%）、水杆形菌属（Undibacterium，1.52%~9.32%）、Clostridium_sensu_stricto（2.62%~10.32%）、贪铜菌属（Cupriavidus，4.31%~9.45%）、紫色杆菌属（Janthinobacterium，1.37%~7.55%）、短波单胞菌属（Brevundimonas，0.31%~5.63%）、梭形杆菌属（Fusibacter，0.55%~0.99%）、温泉胞菌属（Fonticella，0.16%~0.91%）、从单胞菌属（Comamonas，0.25%~0.73%）、弓形菌属（Arcobacter，0.08%~0.63%）、unclassified_Oxalobacteraceae（0.11%~0.63%）、龙包茨氏菌属（Romboutsia，0.12%~0.28%）、纤维单胞菌属（Cellulomonas，0.037%~0.23%）、土生孢杆菌属（Terrisporobacter，0.024%~0.17%）、解蛋白质菌属（Proteiniclasticum，0.05%~0.15%）的相对丰度都有所增加。其中unclassified_Enterobacteriaceae、Pseudomonas、Undibacterium、Clostridium_sensu_stricto、Cupriavidus、Janthinobacterium、Brevundimonas在NP驯化过程中，不同厂污泥中平均相对丰度超过5%且相比未驯化前增加2倍以上〔图2（d）〕，上述菌属即为MMI 技术富集分离识别出的具有潜在降解NP 性能的关键功能菌属。研究表明，贪铜菌〔25〕、假单胞菌〔26〕均可降解NP，降解率在49.63%~72.83%之间；Undibacterium对内分泌干扰物邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的降解有一定促进作用〔27〕；Enterobacteriaceae细菌多具有抗生素耐药基因〔28〕；Clostridium_sensu_stricto可促进醇类的氧化〔29〕；Janthinobacterium可进行异养硝化作用〔30〕；Brevundimonas具有耐药性且对有机磷农药有降解作用〔31〕。因此，基于MMI 富集分离识别的潜在关键菌属包括抗药优势菌株、NP 主要代谢菌株、氮磷代谢菌株，其中以抗药优势菌、NP 主要代谢菌优势最大，是NP 降解的关键功能菌。

2.2 壬基酚降解菌的筛选、构建与评价

在NP 选择培养基中，采用稀释涂布法从MMI 富集分离后的活性污泥样本中共筛选获得12 株生长较快的菌株。经纯化分离扩大培养、革兰氏染色及16S rRNA 鉴定（表2），本研究获得2 株柠檬酸杆菌（Citrobacter freundiistrain WXC-1、Citrobacter werkmaniistrain ZXC-1）、2 株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilastrain ZXB-1、Aeromonas hydrophilastrain YZC-2）、1 株水稻食酸菌（Acidovorax oryzaeZXB-4）、2 株假单胞菌（Pseudomonas veroniistrain ZXB-2、Pseudomonas sivasensisstrain WXB-4）、1 株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilissubsp. WXB-1）、1 株贪铜菌（Cupriavidus basilensisstrain YZB-1）、2 株肠杆菌（Enterobacter moristrain WXB-3、Enterobacter moristrain WXB-2）、1 株类肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniaeYZC-1）。其中肠杆菌、假单胞菌和贪铜菌与微生物群落中识别的NP 降解关键功能菌属一致，表明肠杆菌、假单胞菌和贪铜菌能够直接利用NP 作为碳源进行代谢。

表2 MMI 富集培养所筛选菌株的形态及鉴定结果Table 2 Morphology and identification results of the strains screened by MMI enrichment culture

上述肠杆菌、假单胞菌和贪铜菌涉及到的5 株降解菌Pseudomonas veroniistrain ZXB-2、Pseudomonas sivasensisstrain WXB-4、Cupriavidus basilensisstrain YZB-1、Enterobacter moristrain WXB-3、Enterobacter moristrain WXB-2 对200 mg/L NP 的降解率见图3。

图3 单一菌株对NP 的降解效率Fig. 3 Degradation efficiency of NP by a single type of strain

由图3 可知，5 株降解菌对NP 的降解速率随时间延长均呈现先增加再降低的趋势，且不同微生物处理下NP 最终降解率差异显著，降解反应7 d 后各菌株对200 mg/L NP 的降解率分别为（86.67±1.21）%、（82.53±3.02）% 、（72.7±3.10）% 、（80.38±1.65）% 、（74.81±1.35）%。优选肠杆菌Enterobacter moristrain WXB-3、假单胞菌Pseudomonas veroniistrain ZXB-2 与贪铜菌Cupriavidus basilensisstrain YZB-1 进行复配，根据驯化后unclassified_Enterobacteriaceae（30.17%）、Pseudomonas（28.63%）、Cupriavidus（9.45%）的相对丰度比2∶2∶1，构建得到NP 降解复合功能菌群，如图4 所示，其对200 mg/L 壬基酚7 d 降解率达到90%以上，相比单一菌株降解效率有所提高，表明菌株之间存在协同作用。杨振东等〔25-26〕通过直接筛选获得的不同NP 降解菌株对NP 的降解率差异较大，在49.63%~72.83%之间；马娟等〔10〕采用未经驯化识别的复配菌株对NP 进行降解，NP降解率达到72.84%~80.00%；本研究基于MMI富集识别筛选得到的NP降解菌对NP的降解率均在70%以上，所构建的复合菌群对NP的降解率可达90.92%。综上，基于MMI驯化富集可有效识别出污泥中污染物关键降解功能菌，且基于富集丰度比例构建所得的复合菌群对NP的降解率比单一菌株提高了4.25%~18.22%，为污染物降解关键功能菌群的构建提供了参考。

图4 复合菌群对NP 的降解效率Fig. 4 Degradation efficiency of NP by complex flora

2.3 复合菌群降解条件响应面优化

初始pH、温度、氧气条件是影响NP生物降解的主要环境因素〔32〕。研究表明，在初始pH 6~9〔26〕、温度25~40 ℃〔25〕、好氧及厌氧条件下NP 均可被生物降解，且好氧条件下NP矿化速率随体系溶解氧浓度升高而显著提高〔33〕。在单因素实验基础上，设置因素最优水平范围，对初始pH、温度及影响体系溶解氧浓度的摇床转速3个因素进行响应面优化。

根据表3所示的正交实验直观分析结果，利用响应面法对复合菌群降解NP 的应用条件进行优化，方差分析结果见表4。建立以pH（A）、温度（B）、摇床转速（C）为自变量，NP去除率（Y，%）为因变量的二次多项式，得到拟合回归模型为：Y=90.03-1.13A-4.48B-2.76C-1.09AB-2.96AC+1.69BC-13.50A2+0.55B2-18.54C2。

表3 复合菌群反应条件响应面优化直观分析Table 3 Reaction condition response surface optimization analysis of complex flora

表4 响应面回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4 可知，模型拟合效果良好（F值为16.57，p<0.001），失拟项对模型的影响不显著（p>0.05），说明该模型能够充分拟合实验数据，准确分析NP 降解率且误差小。一次项B对模型的影响为显著（p<0.05），二次项A2和C2对模型的影响均极显著（p<0.01）。其中温度p值小于0.05，表示温度对NP 降解效率影响显著。

模型的决定系数R2为0.955 2，校正决定系数AdjR-Squared 为0.897 5，表明模型的相关度较好。响应面图是响应值和各因素构成的三维空间的曲面图，等高线图的形状传达了交互作用的水平和性质。 本研究所得响应面图和等高线图见图5。

图5 不同因素交互作用对NP 去除率的响应面图和等高线图Fig. 5 Response surface and contour plots of the interaction of different factors on NP removal rate

由图5 可知，pH-温度、温度-摇床转速曲面呈现不均匀的变化且等高线中无完整的椭圆形，表明其交互作用显著且温度的影响最显著。pH-摇床转速曲面呈现完整的椭圆形且摇床转速变化方向等高线较密集，表明pH 与摇床转速交互作用不显著，摇床转速影响更显著。因此，影响NP 降解率的因素顺序为：温度（B）>摇床转速（C）>pH（A）。经过二元多项式的拟合和曲面分析，预测复合功能菌群的最佳应用条件为：pH 6.87、温度30.16 ℃、摇床转速141.57 r/min，此条件下，降解7 d 后NP 降解率可达（94.80±4.19）%。

在优化条件下，通过测量NP 的残余量、菌体的生长量可获得复合功能菌群生长曲线和NP 降解曲线，结果见图6。

由图6 可知，复合功能菌群适应期较短，0~2 h 生物量即有增长；2~72 h 时，复合功能菌群进入对数生长期，OD600值显著增加；72 h 后功能菌群基本进入稳定期，微生物浓度不再增加，且随着时间的增加有降低的趋势。NP 降解实验表明，初始NP 质量浓度为200 mg/L 时，菌群对环境适应较快，降解底物充足，功能菌群对NP 的降解速率随着功能菌群生物量的增加而增加，且降解速率较快；进入稳定期后NP 持续降解但趋于平稳，在第7 天NP 降解率达到96.87%，与预测值较吻合。

2.4 复合菌群的壬基酚降解动力学分析

在优化条件下，采用复合功能菌群处理NP 质量浓度分别为1、200 mg/L 的实际印染废水，考察NP 降解速率，并采用动力学模型对其进行拟合，较优拟合结果见图7、表5。

图7 最优条件下复合菌群处理实际废水中NP 的降解动力学曲线Fig. 7 Kinetic curve of NP degradation in practical wastewater treated by complex flora under optimal conditions

表5 复合菌群降解不同浓度NP 的动力学方程及半衰期Table 5 Kinetic equation and half-life of NP degradation by complex flora

如图7 所示，在最优反应条件下，复合菌群对实际废水的适应性较好，反应30 h 后其对低质量浓度NP（1 mg/L）的降解率可达100%，降解过程较符合一级动力学反应；反应7 d 后对高质量浓度NP（200 mg/L）的降解率可达92.8%，降解过程较符合零级动力学反应。表5 显示复合菌群对低质量浓度NP（1 mg/L）的降解半衰期为（7.69±0.05） h，对高质量浓度NP（1 mg/L）的降解半衰期为（3.11±0.11） d。杨振东等〔25〕研究发现，微生物对NP（10 mg/L 以下）的降解过程一般符合一级动力学曲线，NP 的半衰期为44.44~48.02 h，本研究构建的复合菌群显著缩短了NP 的降解半衰期，且对高浓度NP 的降解反应更接近零级动力学模型，这可能与高浓度NP 存在的毒性有关，高浓度条件下初期污水毒性较强，对生物降解存在一定抑制作用。

2.5 壬基酚生物降解过程的毒性评估

复合功能菌群处理不同浓度NP 实际废水过程中水质急性毒性与类雌激素效应变化情况见图8。

图8 复合菌群处理实际废水过程中急性毒性和类雌激素效应变化（*p<0.05，**p<0.01）Fig. 8 Changes of acute toxicity and estrogenic effect in the treatment of practical wastewater by complex flora（*p<0.05，**p<0.01）

由图8 可知，复合功能菌群对NP 的解毒效果显著。当NP 质量浓度为1 mg/L 时，实际废水的急性毒性表现为低毒（HgCl2毒性当量<0.07）〔34〕，雌激素活性相当于0.68 ng/L 雌二醇（E2）；随着处理时间的增加，对照组急性毒性和类雌激素效应有一定程度降低但不显著，处理组急性毒性和类雌激素效应则随时间的增加而降低，6 h 后其急性毒性和类雌激素效应较对照组降低显著，最终处理组急性毒性和类雌激素效应较对照组分别降低了64.29%和76.47%。当NP 质量浓度为200 mg/L 时，实际废水急性毒性表现为高毒（0.12

3 结论

1）基于MMI富集分离方法从不同印染废水活性污泥中富集的优势菌包括unclassified_Enterobacteriaceae（30.17%）、Pseudomonas（28.63%）、Undibacterium（9.32%）、Clostridium_sensu_stricto（10.32%）、Cupriavidus（9.45%）、Janthinobacterium（7.55%）、Brevundimonas（5.63%），其中unclassified_Enterobacteriaceae、 Pseudomonas、 Undibacterium、Clostridium_sensu_stricto、Cupriavidus为主要的碳代谢菌株，是潜在的NP 降解关键功能菌属。

2）从驯化富集的活性污泥中筛选获得NP 降解关键功能菌Pseudomonas veroniistrain ZXB-2、Pseudomonas sivasensisstrain WXB-4、Cupriavidus basilensisstrain YZB-1、Enterobacter moristrain WXB-3、Enterobacter moristrain WXB-2，其对200 mg/L NP 的降解率分别为86.67%、82.53%、72.7%、80.38%、74.81%；由此构建NP 降解复合功能菌群，该菌群对200 mg/L NP降解率达90%以上。

3）响应面优化得到复合菌群降解NP 的影响因素及其排序为温度>摇床转速>pH，最佳应用条件为pH 6.87、温度30.16 ℃、摇床转速141.57 r/min，此条件下复合菌群对200 mg/L NP 的降解率达96.87%。

4）复合菌群降解实际废水中低质量浓度NP（1 mg/L）的过程较符合一级动力学模型，NP 半衰期为（7.69±0.05） h；降解实际废水中高质量浓度NP（200 mg/L）的过程较符合零级动力学模型，NP半衰期为（3.11±0.11） d。

5）功能菌群对实际废水的脱毒效果显著，低质量浓度NP（1 mg/L）废水经处理后，急性毒性和类雌激素效应分别降低64.29%和76.47%；高质量浓度NP（200 mg/L）废水经处理后，急性毒性由高毒降为低毒，毒性降低了58.21%，类雌激素效应降低了88.34%。