拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌的分离与鉴定*

郑艳艳 曹亚璞 王艳红 郭小芳**

（1.西藏大学理学院，西藏 拉萨 850000；2.云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会教育部重点实验室，云南 昆明 650091）

大棚果蔬的兴起对于我们来说有着诸多益处，例如某些果蔬只在特定的季节才能在自然条件下进行种植，这使其生产大大受到限制，自从有了大棚果蔬的种植，人们食用反季节果蔬成为现实；另一方面实现了农业的可持续增收，这同时也推动了果蔬大棚的发展[1]。目前大棚条件下的微生物群落组成及其多样性已经成为了研究热点，因为大棚种植与自然露天种植相比，其生存环境有所改变，结果必将伴随着该环境下微生物群落结构的改变。李玉娣等[2]研究表明陕西一果蔬大棚中的微生物总丰度与大棚棚龄呈正相关，并随着大棚棚龄的增加而出现最大值。王阳等[3]同样研究了蔬菜大棚土壤微生物的多样性，结果表明其微生物多样性随着大棚棚龄的增加而增加。

青藏地区海拔高，气候环境恶劣，果蔬的种植条件相对来说比较苛刻，因此该地区大棚果蔬的种植面积越来越大。现在困扰种植农户的仍然是果蔬的病害威胁问题，导致此问题的因素有很多，在果蔬病害中，绝大部分的病害威胁是由于丝状真菌的侵染所导致的。在果蔬的霉变过程中，最常见的霉菌就是青霉[4]。近年来，我国学者在果蔬真菌方面的研究也取得了一定的成果，杜公福等[5]对海南冬季蔬菜无性型真菌多样性进行了研究，结果表明海南岛冬季蔬菜病害种类多，病原菌种类丰富。古佳妍等[6]对广州地区的6 种野生蔬菜进行了研究，结果明确了8 种病害真菌。现今关于青藏地区大棚果蔬中丝状真菌的研究鲜见报道，而且由于霉菌导致的果蔬腐烂变质而引起的损失是不可估量的，且霉菌所产生的毒素往往严重影响人类的健康，因此开展果蔬中丝状真菌的研究刻不容缓。开展拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中丝状真菌分离与鉴定的研究，以期为拉萨市果蔬病害的生物防治奠定基础，并为构建青藏地区丝状真菌资源库提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样品果蔬及所在大棚概况

在拉萨市蔡公堂乡分别选取5个不同条件的大棚（不同棚龄、不同地理位置、不同果蔬品种）进行供试果蔬的采集，果蔬样品的具体概况如表1所示。

表1 果蔬品种及其所在大棚概况

1.2 样品果蔬的采集

于拉萨市蔡公堂乡果蔬大棚中摘取11 种样品果蔬，用无菌封口袋将其装入后立即带回实验室分离培养其中的丝状真菌。

1.3 丝状真菌的分离纯化

将每种供试果蔬制得10-1与10-2的稀释液并各取200μL 分别直接涂布于酸化YM 及酸化PDA 平板上，每个处理设3 个重复。在室温下培养3～5 天后选取菌落长势较为均匀的平板记录丝状真菌菌落数，并将单菌落分别接于YPD斜面进行纯化。

1.4 丝状真菌的分类鉴定

采用经典分类法结合26S rDNA D1/D2 区域序列分析法对获得的丝状真菌菌株进行鉴定，将供试菌株26S rDNA D1/D2区域序列在NCBI数据库中进行对比来确定其地位。

1.5 数据处理

采用Excel 2010对分离所得丝状真菌的物种组成数据进行处理与分析，采用R 3.6.3 对Shannon-Wiener多样性指数（H’）、Simpson多样性指数（D）、Pielou 均匀度指数（J’）及Jaccard相似度系数进行计算，绘图采用Origin 2019b进行。

2 结果 与分析

2.1 拉萨蔡公堂大棚果蔬丝状真菌物种组成

2.1.1 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌种水平分析。从采样果蔬大棚中共采集11种果蔬，对其进行丝状真菌的分离鉴定。研究结果表明11 种供试果蔬中共分离到49株丝状真菌（仅西瓜中未分离到），对其进行鉴定，将其归为5属12种。图1结果表明，5个属的丝状真菌中，Cladosporium属种类最多，为5 个种，其次是Mucor 属，为3 个种，Fusarium属分离到2 个种，其余2 个属Aspergillus与Penicillium则均仅分离到1个种。

图1 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌种水平组成情况

分析12 种丝状真菌在10 种供试蔬菜中的出现频率，可以看出，Fusarium sp.出现频率最高，为50%；其次是Aspergillus tubingensis，出现频率为40%；其中Cladosporium cladosporioides、Cladosporium sp.与Fusar⁃ium incarnatum等5 个种丝状真菌仅在1 种果蔬中分离到，出现频率均仅为10%.

不同种丝状真菌相对丰度显示，分离到的12种丝状真菌中，Mucor circinelloides相对丰度最高，为22.45%；其次是Aspergillus tubingensis，相对丰度为14.29%.此外，Cladosporium sphaerospermum、Cladospo⁃rium tenuissimum与Cladosporium uredinicola等4 种 丝状真菌的相对丰度均大于10%.因此，Aspergillus tubin⁃gensis、Fusarium sp.与Mucor circinelloides等6 个种均为拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中丝状真菌的优势种。

2.1.2 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌属水平分析。图2 数据显示，Fusarium 属出现频率最高（60%），在6 种供试果蔬中均被分离到；其次是Cladosporium属（50%），在5 种供试果蔬中被分离到；而Penicillium属的出现频率仅为10%.

图2 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌属组成状况

分析相对丰度可知，Cladosporium属相对丰度最高，为36.73%；其次是Mucor，相对丰度为30.61%；Penicillium属相对丰度最低，仅分离到1 株，相对丰度仅为2.04%.

2.2 拉萨蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌相似性分析

2.2.1 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌种水平相似性。图3 数据表明，拉萨市蔡公堂乡大棚不同果蔬间丝状真菌种水平Jaccard相似性系数范围为0～1。其中青椒与茄子、青椒与四季豆等6 组果蔬间相似性系数为0.75～1，为极相似水平，比例占13.33%；草莓与圣女果、草莓与玉米等7组果蔬间相似性系数为0.25～0.5，为中等不相似水平，比例占15.56%；草莓与番茄、草莓与青椒等32组果蔬间相似性系数为0～0.25，为极不相似水平，比例占71.11%.不同果蔬间丝状真菌种水平Jaccard 相似性系数平均值为0.19，为极不相似水平。由此可知，拉萨市蔡公堂乡大棚中供试果蔬表面丝状真菌群落组成在种水平上存在较大差异。

图3 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌种水平Jaccard相似度系数

2.2.2 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌属水平相似性分析。图4 数据表明，拉萨市蔡公堂乡大棚不同果蔬间丝状真菌属水平Jaccard相似性系数为0～1。其中番茄与青椒、番茄与茄子等11组果蔬间相似性系数为0.75～1，为极相似水平，比例占24.44%；草莓与玉米、草莓与苦瓜等6 组果蔬间相似性系数为0.5～0.75，为中等相似水平，比例占13.33%；草莓与圣女果、草莓与红椒等3 组果蔬间相似性系数为0.25～0.5，为中等不相似水平，比例占6.67%；草莓与番茄、草莓与青椒等25 组果蔬间相似性系数为0～0.25，为极不相似水平，比例占55.56%.不同果蔬间丝状真菌属水平Jac⁃card相似性系数平均值为0.38，为中等不相似水平。由此可知，拉萨市蔡公堂乡大棚中供试果蔬表明丝状真菌群落组成在属水平上也存在一定差异。

图4 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬丝状真菌属水平Jaccard系数

2.3 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中丝状真菌多样性分析

图5 数据显示，供试的10 种果蔬中，丝状真菌种数与属数最多的均为草莓，种数与属数分别为7 和5；其次是苦瓜，种数与属数分别为6 和3；而番茄、青椒与茄子等5 种果蔬种类最少，种数与属数均仅为1。总丰度数据表明，10 种果蔬中，圣女果中丝状真菌总丰度最大，为2.5×105；其次是草莓、苦瓜与红椒；相对而言，茄子中丝状真菌的总丰度最小，为1×103。多样性指数数据表明，草莓的多样性指数最高且分布最均匀，其次是苦瓜，而番茄、青椒与茄子等5 个品种果蔬的3种多样性指数均为0。

图5 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中丝状真菌多样性分析

3 结论和讨论

从采样大棚基地采摘的11 个果蔬品种中共分离到49 株丝状真菌，分子鉴定与经典分类结果显示，这些丝状真菌菌株归于5 个属12 个种。Aspergillus tub⁃ingensis、Fusarium sp.与Mucor circinelloides等6个种均为拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中丝状真菌的优势种。其中Mucor circinelloides相对丰度最高，为22.45%.这些种属的丝状真菌几乎均能导致果蔬的腐烂变质。耿阳阳等［7］从霉变核桃中共分离出4 株病原丝状真菌，主要为Mucor、Fusarium 与Aspergillus，该研究表明引起“纸皮核桃”发生腐烂变质的主要丝状真菌菌种为Mucor circinelloides等；关波等［8］研究表明导致新疆石河子地区甜樱桃果实腐烂的致病真菌主要有Mu⁃cor fragilis、Fusarium sp.等；崔志婧等［9］对上海市销售的进口火龙果中的病害丝状真菌进行了分离与鉴定，研究结果表明该火龙果中两种主要的致病霉菌均为Fusarium；张全党等［10］对阿勒泰地区大豆主要栽培区大豆根腐病病株进行了分离和鉴定，研究表明该地区大豆根腐病主要病原为Fusarium sp.；何祥祥［11］等为评估浙江地区基地温棚和市售草莓的微生物污染情况开展了相关研究，对其中的丝状真菌进行了分离鉴定，结果表明分离到的5株丝状真菌为Mucor与Fusar⁃ium，总丰度为0～2900cfu/g。除此之外，有一些专家学者的研究结果与本文研究结果有着一定差异。有研究发现，草莓果实采后容易发生的霉菌病害主要有草莓灰霉病、草莓软腐病等，分别由Botrytis cinerea、Rhi⁃zopus stolonifer及Colletotrichum acutatum等引起，此外，侵染采后草莓果实的病原真菌还有Mucor pirifor⁃mis、Mucor nucedo、Rhizopus spp.等［12］，但在本实验中却分离出Mucor racemosus、Fusarium incarnatum、Penicil⁃lium olsonii、Cladosporium tenuissimum、Aspergillus tub⁃ingensis、Cladosporium uredinicola、Mucor circinelloides共5 属7 种丝状真菌。本研究玉米中分离到大量的Mucor circinelloides，而在对贮藏玉米丝状真菌体系的研究中并未发现此类丝状真菌。在拉萨蔡公堂中所采集的11 种供试蔬菜中，Cladosporium属的丝状真菌占比最多，而这类丝状真菌是各种着斑病的主要病因。由于海拔、温度、紫外线强度等条件，与内地果蔬相比，拉萨果蔬表面所分离到的丝状真菌有很大的差异。

研究结果显示，11 个供试果蔬品种中只有1 个果蔬品种（西瓜）中未分离到丝状真菌，其可能是因为采摘过程中西瓜已经下架，研究所选取的为已下架的西瓜，再加上青藏地区紫外辐射强，在阳光的强烈照射下，丝状真菌无法继续在西瓜中生存繁殖。此外，本研究发现同一蔬菜品种中的青椒和红椒表面所分离得到的丝状真菌无论是总丰度还是种类数上都存在着很大的差异，究其原因，可能是因为两种蔬菜中所含营养成分有所不同，红椒中各类元素常常高于青椒，且可溶性糖含量也相对较高［13］，这些原因可能都会导致这两个品种中丝状真菌的物种组成存在差异。

曹亚璞等［14］分析了拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬表面酵母菌，为了探讨酵母菌与丝状真菌之间是否存在相互制约关系，对其进行了相关性分析。图6 为拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中所分离到的酵母菌多样性指数与丝状真菌多样性指数间的相关性分析，从图中可看出，拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中酵母菌总丰度与丝状真菌总丰度呈极显著正相关(P＜0.01)，除此之外，酵母菌属数和酵母菌H’与丝状真菌J’间均呈显著正相关(P＜0.05)。该分析结果表明，拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中所分离得到的酵母菌与丝状真菌间可能在一定程度上有着相互影响，但没有呈现出相互抑制作用，可能与酵母菌和丝状真菌对营养物质的一致需求有关。

图6 拉萨市蔡公堂乡大棚果蔬中酵母菌与丝状真菌间相关性分析

为了解丝状真菌对拉萨蔡公堂果蔬的具体病害，笔者将会在后续对蔬菜病害的生物防治进行研究，这对提高青藏高原地区的的果蔬质量有着重要的意义。