一种PCR 仪温度校准装置的溯源方法研究

王在旗 纪金龙 沈在钦 谢学江

（作者单位：厦门市计量检定测试院）

引言

自2020 年暴发全球性新冠肺炎疫情以来，针对新型冠状病毒的核酸检测方法和设备——聚合酶链反应分析仪（也称基因扩增仪，以下简称PCR仪）的研究受到了极大的重视，发展迅速。聚合酶链式反应技术（简称PCR 技术）出现于20 世纪80 年代，经过长期的应用、优化和发展，已成为分子生物学领域的一项关键技术。其主要是对链式反应温度进行快速改变和精确控制，通过重复循环变性-退火-延伸实现DNA 序列的体外扩增，从而为进一步的基因检测提供足够多的DNA 片段。

PCR 仪最主要的计量参数是温度，温度的准确性、均匀性，升温速率和降温速率等技术指标的优劣直接影响了DNA 序列的扩增效果。如果温度出现较大的非期望偏离，获得的DNA 片段数量无法满足后续核酸测序的需要，可能直接导致“漏检”现象，埋下疫情扩散的隐患。目前，各级医疗机构，特别是城市核酸检测基地都配置了大量的PCR仪，对其性能的要求也越来越高，这意味着对PCR仪温度校准装置的要求也不断提高。为确保PCR仪温度的准确可靠，本文拟从PCR 仪温度校准装置的溯源方法研究着手，提升PCR 仪温度校准装置测量结果的置信水平，保证其对PCR 仪溯源结果的准确可靠。

PCR 仪及其温度校准装置概述

PCR 仪市场巨大，国内外品牌及设备类型众多，但是其加热模块基本上都是扁平板状多孔设计，有24 孔、48 孔、96 孔、384 孔等，其中又以96 孔的PCR 仪最为常见。图1 是一款比较常见的96孔PCR 仪。

1.PCR 仪的作用及原理

当采集到的样品中DNA 含量太低，无法满足正常仪器进行检测分析的量，就需要将样品溶解在特定溶剂中，通过PCR 仪来实现样品中DNA 的扩增，扩增的倍数为2 的N 次方。其工作原理是：双链DNA 在一定的环境中，通过在90～95℃变性，形成单链，然后退火降温到40～60℃，在引物及其他辅助因子的作用下，使其初步结合，再快速升温至70～75℃，在相关酶的催化作用下，合成双链，完成一个扩增循环。通过PCR 仪对温度的精确控制和快速循环，达到短时间内高效扩增的效果。

2.PCR 仪温度校准装置

PCR 仪温度校准装置是用于校准PCR 仪温度参数的标准装置，JJF1821—2020 《聚合酶链反应分析仪温度校准装置校准规范》明确提出校准装置组成应包含通常为15 个的数据采集分析模块、精密温度传感器，测温范围介于0～120℃之间，测量不确定度不超过0.1℃，且要求定期进行计量检定。图2 是一款常见的PCR 仪温度校准装置，其核心部件是作为传感器的测温模块，一般采用高精度热敏电阻探头，并结合PCR 仪测试孔的形状，封装成扁平类采集器，使其与PCR仪完美贴合，确保测温结果更加真实准确。

PCR 仪温度校准装置的溯源方法研究

2020 年国家市场监督管理总局发布了JJF1821—2020《聚合酶链反应分析仪温度校准装置校准规范》，为PCR 仪温度校准装置的溯源提供了方法依据以及标准装置的性能指标要求。采用二等及以上等级的标准铂电阻温度计与0.005级的电测设备连接构成高精度测温系统对校准装置性能进行验证，同时要求作为提供恒定温场的主要配套设备——恒温槽及均温块也提出了一定的要求，见下表，均温块见图3。

主要配套设备的性能指标表

规程JJF1821—2020 采用的校准方案是将PCR 仪温度校准装置的测温模块封装在均温块内部，并整体浸入恒温槽中，温度稳定之后读取测量值。但是这种方法存在两个方面的主要问题：一是对均温块的要求较高，需要绝对密封且无空气存在，并且测温模块的传感器头要求与均温块紧密贴合。其次均温块大部分采用不锈钢材料制成，即使大部分浸入恒温槽中，仍会存在较大的轴向导热，直接影响测试孔的温度。二是这种溯源方案只能对PCR 仪温度校准装置进行定值溯源，无法对测温模块传感器的响应情况进行校准，无法满足PCR 仪升降温速率测量的溯源要求。因此本文提出了一种采用一体化快速热循环温变系统对测温模块传感器进行直接测温的溯源方法，模拟实际PCR 仪工作过程，避免了由均温块引入的一系列测量不确定因素，提升了操作便利性以及测量精度，满足溯源要求。设计流程图见图4。

首先，测温模块通过模拟PCR 仪的加热板设计，测试孔的位置形状能够与PCR 仪测温模板的传感器头完全贴合。整体采用紫铜材料，孔腔镀金，提高抗氧化性。测温板内部为空腔，高导热液在空腔中快速流动，其中测温孔腔与导热液体充分接触，能够实现快速换热和平衡。其次，热液系统和冷液系统通过流量控制系统将导热液进行混合后快速泵入测温模块的空腔内，温度测控系统测量测温模块空腔内的液体温度并反馈给热液系统和冷液系统的相关控制模块和流量控制系统，进一步调节混合导热液体的温度，达到快速升降温的目的。最后，回液系统再将导热液分流至冷热液系统，实现高效循环。

总结

PCR 仪通过对基因的快速扩增，满足了目前新冠病毒核酸检测样本数量的需要，是核酸检测最主要的设备之一。确保PCR 仪参数准确、性能可靠，需要按照国家的规程规范，利用PCR 仪温度校准装置进行计量。而PCR 仪温度校准装置作为标准装置，其计量性能确认无疑是更加重要。本文通过分析目前常规溯源方法，发现采用均温块的方案存在诸多容易引入误差的不确定因素，因此进一步提出采用导热液快速循环换热系统对测温模块的传感器进行直接溯源的方法，这对于PCR 仪温度校准装置的溯源方法和标准装置的改进具有一定的参考价值。