基于游离氨基酸含量的卷烟刺激性评价模型构建

田数，李力群，郑美玲，郭春生，叶亚军，陈晨，赵怡凡，张峻松

1.内蒙古昆明卷烟有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010020；2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001

0 引言

氨基酸是烟草中重要的含氮化合物之一，对烟草的感官评吸品质和吸烟者的健康有很大影响[1-5].在调制和醇化过程中，烟叶中的氨基酸会与还原糖发生美拉德反应，生成一系列醛类、醇类、杂环类等对烟草香味有重要影响的化合物[6-10]. 在卷烟燃吸过程中，氨基酸则会产生烧焦羽毛的气味，对烟气吸味造成不良影响[11]. 一般认为，氨基酸含量过高，抽吸时刺激性强烈，而含量太低时，则烟气劲头不足，丰满度差[12-15].

刺激性是指抽吸卷烟时烟气对感官产生的一种不舒适感受，具体表现为对口腔的冲刺和撞击，使舌面产生毛刺和辣感. 刺激性作为评价卷烟内在品质的一个重要指标，一直是行业内研究的热点[16]. 近年来，关于游离氨基酸与刺激性的关联性已有多项研究成果. 王光耀等[17]研究发现，酰胺类游离氨基酸与卷烟刺激性存在极显著正相关关系；邓国宾等[12]通过主成分分析及相关性分析发现，酪氨酸、蛋氨酸与卷烟刺激性呈显著正相关关系；殷延齐等[11]研究发现，不同品牌卷烟中各种氨基酸的含量分布对卷烟刺激性的评价有一定参考价值. 但目前尚未见到基于卷烟中游离氨基酸含量构建评价模型来预测卷烟刺激性指标的研究报道. 鉴于此，本研究拟以市场上12种不同风格的卷烟为研究对象，采用高效液相色谱法对其游离氨基酸进行测定，利用主成分分析法建立一种基于游离氨基酸含量的卷烟刺激性评价模型，通过对卷烟抽吸时刺激性大小的预测优化制备工艺，提升卷烟内在品质.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

购买市售的12种不同风格卷烟，分别是绵柔香(C1)、自然本香(C2)、烤甜香(C3)、清甜香(C4)、酒香(C5)、树苔香(C6)、清香(C7)、焦甜香(C8)、复合香(C9)、淡雅香(C10)、本草香(C11)、奶甜香(C12).

天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu),以上试剂纯度均≥99%，三乙胺、氢氧化钠、盐酸、冰乙酸(分析纯)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸钠、邻苯二甲醛(纯度为99%)，甲醇、四氢呋喃、乙腈(色谱纯)，四硼酸钠(优级纯)，购自天津市富宇精细化工有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制样品溶液制备：将剥离后的卷烟烟丝于40 ℃条件下干燥2 h，利用磨粉机粉碎、过40目筛后混合均匀，密封储存. 称取粉碎后的烟末2.0 g(精确至0.000 1 g)于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/mL的盐酸溶液定容后超声萃取20 min，再以9000 r/min的转速高速离心20 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，即得样品溶液.

氨基酸工作液的配制：分别称取16种氨基酸标准品于100 mL容量瓶中，以0.1 mol/mL的盐酸溶液配制浓度为2.5 μmol/mL的氨基酸标准储备液;移取氨基酸标准储备液配制浓度分别为4 nmol/mL、20 nmol/mL、50 nmol/mL、125 nmol/mL、250 nmol/mL、2500 nmol/mL的氨基酸混合标准工作液.

衍生化试剂的配制：称取邻苯二甲醛固体5 mg于2 mL色谱瓶中，加入0.1 mL甲醇，再加入1 mL 浓度为0.4 mol/L的硼酸缓冲液(pH=10.4)，充分振荡溶解，再加入20 μL 3-巯基丙酸，混匀后置于4 ℃的冰箱中,备用.

1.2.2 高效液相色谱分析条件流动相A：称取2.494 g醋酸钠溶于适量水中，加入200 μL三乙胺，用体积分数为1%的醋酸溶液调节pH值至7.2，再加入3 mL四氢呋喃，定容至1 L，经0.45 μm滤膜过滤，备用. 流动相B：称取13.608 g醋酸钠溶于适量水中，用体积分数为1%的醋酸溶液调节pH值至7.2，定容至1 L；取醋酸钠溶液200 mL，分别加入400 mL甲醇、400 mL乙氰，混匀后经0.45 μm滤膜过滤，备用.

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱温40 ℃，流速为1 mL/min，进样量10 μL；荧光检测器激发波长350 nm，发射波长450 nm.流动相洗脱程序：0～0.5 min，0%～1%流动相B；0.5～17 min，1%～7%流动相B；17～21 min，7%～10%流动相B；21～30 min，10%～13%流动相B；34～37 min，13%～100%流动相B；37～42 min，100%流动相B；42～45 min，100%～0%流动相B；45～55 min，100%流动相A.

样品溶液和氨基酸工作液衍生化反应由自动进样器完成，自动进样程序参照冯雷等[18]的方法进行.

1.2.3 卷烟感官评吸参照《卷烟 第4部分 感官技术要求》(GB 5604.4—2005)[19]，组织内蒙古昆明卷烟有限责任公司技术中心评吸委员会7名成员进行评吸，对刺激性指标进行打分. 满分20分，分值越高,表明刺激性越小.

1.3 统计分析方法

对实验数据进行整理，利用SPSS 25.0进行相关性分析、主成分分析和聚类分析.

从此，他们搬到东泉岭茶楼来住了。林燕已经长成一个小姑娘了，跟红琴小时候一模一样，看着林燕，风影的心中就隐隐作痛，林间微凉的风吹拂着他们，他仿佛进入了一个迷蒙的意境，一个关于小和尚与小女孩的纯美记忆。他做梦也不会想到，那个天使一般的小女孩红琴，有朝一日会成为这个混沌世界的祭品。他什么话也没有说，眼睛清澈如水，似有泪光闪烁，一朵孤云从深谷飘起，也映入了他的眼帘。随后，他的眼中便水汽氤氲了。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸含量与刺激性关系模型

2.1.1 游离氨基酸含量与刺激性的差异性分析对工作标准溶液进行色谱测定，以各氨基酸浓度(X)为横坐标，各组分响应峰面积(Y)为纵坐标建立回归方程，氨基酸标准品的保留时间及回归方程见表1. 由表1可知，16种氨基酸在4～2500 nmol/mL浓度范围内均线性良好(R2≥0.99)，可以满足卷烟烟丝中16种氨基酸的检测分析要求.

表1 氨基酸标准品的保留时间及回归方程Table 1 Retention time and regression equation of amino acid standards

不同风格卷烟中游离氨基酸含量分析结果如表2所示. 由表2可知，在12种卷烟样品中均检测到上述16种游离氨基酸，不同风格卷烟中游离氨基酸含量差异明显. 从游离氨基酸的总含量来看，其变化范围为852.09～1 810.22 μg/g. 其中C7中游离氨基酸总含量最高，为1 810.22 μg/g，C4(1 739.75 μg/g)和C1(1 721.98 μg/g)次之，C1卷烟的叶组配方以四川烟叶为主要原料，而C4和C7卷烟的叶组配方以云南烟叶为主要原料. 这两个产区烟叶中多数游离氨基酸含量中等偏高，但丙氨酸含量较高，这与袁帅等[20]的研究结果一致. C5卷烟以贵州烟区烟叶为主要原料，该烟区烟叶游离氨基酸含量较低[20]，因此C5卷烟中游离氨基酸总含量最低，为852.09 μg/g. 从各种游离氨基酸的含量来看，不同风格卷烟中Asp含量均大于其余15种氨基酸含量，占氨基酸总量的21.76%～29.90%，这与殷延齐等[11]的研究结果基本一致；Gly、Lys含量在各类型卷烟中均未超过1%；C11中Met的含量明显高于其他类型卷烟.

表2 不同风格卷烟中游离氨基酸含量Table 2 Free amino acid contents in different styles of cigarettes μg/g

卷烟感官评吸刺激性得分结果如表3所示. 由表3可知，C5、C6和C9卷烟刺激性指标得分为18.14～19.36，基本感受不到刺激性；C2、C3、C4、C8、C10、C11、C12刺激性指标得分为16.00～17.57，略有刺激性；C1和C7刺激性指标得分分别为15.57和15.00，刺激性较强.

表3 卷烟刺激性感官评吸得分结果Table 3 Sensory evaluation score of cigarette irritation 分

2.1.2 游离氨基酸含量与刺激性的相关性分析对12种风格卷烟的16种游离氨基酸与刺激性指标得分进行相关性分析，结果见表4. 由表4可见，各氨基酸指标之间既有正相关又有负相关，绝大多数相关关系的绝对值大于0.5，表明指标间具有较强的相关性[21].特别地，Asp与Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Tyr、Phe、Ile、Lys存在极显著(P<0.01)正相关，与Val、Trp和Leu存在显著(P<0.05)正相关.Met与其他氨基酸均不存在显著相关性(P≥0.05).Ile与Phe呈极显著(P<0.01)正相关，相关系数达0.968，高于其他所有相关系数. 游离氨基酸总含量与刺激性指标得分之间呈现极显著负相关，表明游离氨基酸含量越高，刺激性指标得分越低，卷烟刺激性越大，这与殷延齐等[11]的研究结果相似. 另外，除Met外，其余氨基酸均与刺激性得分之间呈现显著负相关性，说明氨基酸含量与刺激性得分的原始指标之间存在较多的共性，直接采用原始指标进行聚类分析会造成信息的重叠，影响结果的客观性，因此要先对原始指标进行降维[22].

表4 不同风格卷烟游离氨基酸与刺激性指标得分间相关性分析Table 4 Correlation analysis between free amino acids and irritation index scores in different styles of cigarettes

2.1.3 游离氨基酸主成分分析及模型的建立对不同风格卷烟的16种氨基酸进行主成分分析，得到第一主成分的特征值和贡献率分别为13.00和81.23%，第二主成分的特征值和贡献率分别为1.24和7.73%，两个主成分的累积贡献率达到88.96%，可以用这两个主成分描述游离氨基酸的整体水平.

由主成分载荷矩阵(见表5)可知，第一主成分主要反映Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Tyr、Val、Trp、Phe、Ile、Lys、Leu共15种游离氨基酸指标的信息，当第一主成分得分越高时，说明这15种游离氨基酸含量越高；Met在第二主成分上的载荷值大于0.9，即第二主成分主要反映Met含量指标的信息，且当第二主成分得分越高时，说明Met游离氨基酸含量越高.

表5 主成分载荷矩阵Table 5 Principal component load matrix

以16种游离氨基酸含量为初始自变量，按顺序分别记为X1～X16，根据各主成分的载荷向量除以各主成分特征值的算术平方根，得出两个主成分的方程表达式如下；F1=0.240X1+0.267X2+0.266X3+

0.263X4+0.268X5+0.273X6+0.272X7+

0.257X8+0.266X9+0.238X10+0.033X11+

0.261X12+0.266X13+0.260X14+0.252X15+

0.214X16

F2=-0.170X1+0.061X2+0.112X3-

0.119X4-0.074X5+0.066X6+0.094X7+

0.106X8+0.136X9-0.250X10+0.873X11+

0.052X12-0.152X13-0.147X14+0.136X15+

0.003X16

以第一、二主成分贡献率大小为分配系数，对两个主成分得分进行加权求和，可得F=0.913F1+0.087F2.不同风格卷烟游离氨基酸含量的综合得分(F)及排名如表6所示. 游离氨基酸含量与卷烟刺激性大小呈现负相关关系，即游离氨基酸含量综合得分越高表示该卷烟刺激性越大，因此,以前述函数作为综合评价模型预测卷烟刺激性大小.

由表6可知，第一、二主成分得分最高的分别是C7和C11. 从不同风格卷烟游离氨基酸主成分综合得分排名可知，C7综合评分最高，C5最低，表明不同风格卷烟的游离氨基酸含量存在差异性.预测C5刺激性最高、C6次之、最后是C7. 12种卷烟游离氨基酸平均综合得分为0，在平均得分附近的有C12、C3、C10、C11、C8和C2，综合得分为-1.395～0.720；远大于平均得分的有C1、C4和C7，综合得分为4.598～5.134；远低于平均得分的有C9、C6和C5，综合得分分别为-3.036、-3.830和-4.391.

表6 不同风格卷烟游离氨基酸 含量的综合得分及排名Table 6 Comprehensive score and ranking of free amino acid content in different styles of cigarettes

2.2 模型验证

2.2.1 基于卷烟游离氨基酸聚类分析的模型验证将12种不同风格卷烟的16种氨基酸含量作为变量，利用SPSS 25.0软件对其进行聚类分析. 采用Ward法，选择欧氏距离进行分析，得到不同风格卷烟的氨基酸含量树状聚类图(见图1). 由图1可知，在欧式距离为2.5时，12种卷烟可分为5类，C2、C8、C10、C3、C12聚为一类，结合氨基酸总量(表2)和刺激性得分结果(表3)发现，该类卷烟游离氨基酸总含量适中，略有刺激性；C5、C6和C9聚为一类，该类卷烟游离氨基酸总含量较低，基本感受不到刺激性；C1、C7聚为一类，该类卷烟游离氨基酸总含量较高，刺激性较强；C4聚为一类；C11聚为一类. 聚类分析结果与主成分分析结果基本一致，这也验证了综合评价模型的可靠性.

图1 不同风格卷烟游离氨基酸含量树状聚类图Fig.1 The tree cluster diagram of free amino acids content in different styles of cigarettes

2.2.2 基于卷烟刺激性感官评价的模型验证基于前期卷烟感官评吸得到的刺激性指标得分评价结果，利用Pearson相关性分析法，将两种分值进行对比分析，结果如表7所示. 由表7可知，两种方法呈现极显著负相关(P<0.01)，相关系数为-0.87，该结果可以进一步验证该模型的可靠性. 感官评吸得到的刺激性指标平均得分与刺激性指标模型综合得分在排序上存在一定的差异性，可能是受到评吸人员和环境的影响，造成两者结果存在一定偏差.

表7 感官评吸结果与模型评价结果对比Table 7 Comparison of sensory evaluation results and model evaluation results

3 结论

本文利用高效液相色谱法测定了12种风格卷烟中游离氨基酸的含量，通过差异性分析、相关性分析、主成分分析建立基于游离氨基酸卷烟刺激性综合评价模型，并通过聚类分析法和刺激性感官评价对该模型进行验证. 结果表明：12种卷烟中游离氨基酸在含量上存在较大差异，Asp在各卷烟中含量最高；建立了综合评价模型F=0.913F1+0.087F2，通过聚类分析可将12种卷烟分为5类，与综合评价模型预测结果基本一致；12种卷烟刺激性感官评价得分排序与综合评价模型预测的刺激性得分排序大体一致；以该模型计算不同类型卷烟游离氨基酸综合评价得分，得分越高表示该卷烟刺激性越大，12种卷烟得分从低到高分别为C5