云烟精油陶瓷膜分离组分的关键香气成分与感官属性的相关性分析

许春平，曲利利，杜欢哲，杨华武

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001;

2.湖南中烟工业有限责任公司 技术中心，湖南 长沙 410007

0 引言

膜分离技术是一种选择性分离技术，其主要通过一系列陶瓷膜和有机膜过滤进而实现不同粒径分子混合物的分离[1-8].近年来，国内一些学者利用该技术对烟叶成分进行提取纯化.如张静楠等[9]将膜分离技术应用于再造烟叶生产，可有效降低烟叶提取液中的烟叶碎渣和蛋白质含量，改善和提高再造烟叶的感官评吸品质；占小林等[10]以广昌晒红烟“黑老虎”烟叶为原料，采用生物酶法和膜分离技术分离纯化“黑老虎”烟叶浸膏，发现添加“黑老虎”浸膏后，干草香、甜香、烘焙香、可可香、辛香、膏香等卷烟风味特征均得到明显提升.近年来，偏最小二乘回归法(PLSR)可说明多个因变量和多个自变量之间的相关性，在生物信息学、食品科学、烟草科学等领域应用广泛[11].殷飞[12]采用PLSR等统计方法建立了清香型卷烟主流烟气化学成分与感官指标之间的相关性模型，结果表明，清香与巨豆三烯酮、花香与丁烯酸呈显著正相关关系，酸香与油酸呈显著负相关关系；周志磊[13]为分析烟气主要甜味物质的来源和形成过程，利用PLSR模型对烟草中46种成分与烟气主要甜味和苦味物质的相关性进行分析，结果表明，13种成分与烟气甜味呈显著正相关关系，5种成分与烟气甜味呈显著负相关关系.

相对气味活度值(ROAV)是分析挥发性香气成分的新方法.在分析古井贡酒、梨酒、竹酒、刺梨果渣、绿茶和鸡蛋干的的关键香气组分相关研究中，均通过比较香味物质ROAV确定关键香气组分，认定ROAV大于1的指标为决定香气的关键因素[14-22].目前，利用ROAV衡量烟草中挥发性成分对烟草整体风味贡献程度的研究，以及利用膜分离技术分离云烟精油后进行PLSR分析的研究鲜见报道.鉴于此，本研究拟通过GC-MS分析云烟精油陶瓷膜分离组分的香气成分，利用主成分分析筛选出对香气贡献较大的关键组分，并计算ROAV以进一步确定云烟精油的关键香味成分，进而分析云烟精油关键香味成分与感官指标的相关性，以期为云烟精油感官品质的研究和控制提供理论依据，为卷烟增香提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

主要材料与试剂：YC7659云烟精油，上海祺源香精香料有限公司产；空白烟，湖南中烟有限责任公司产；无水乙醇(色谱纯)，天津市富宇精细化工有限公司产；石油醚、乙酸乙酯均为色谱纯，天津市津东天正精细化学试剂厂产.

主要仪器：BONA-GM-18型陶瓷膜分离实验机，济南博纳生物技术有限公司产；Agilent GC6890-MS5973N 型气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司产；EYELAN-2100型全自动旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司产；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵，郑州瑞涵实验仪器有限公司产；DLSB-5/10型低温冷却循环泵，郑州凯鹏实验仪器有限公司产；HRH-186K香精注射机，北京慧荣和科技有限公司产.

1.2 实验方法

1.2.1 云烟精油的膜分离准确称取50.00 g云烟精油于1000 mL烧杯中，加入500 mL体积分数为20%的乙醇，待精油完全溶解后，用 50 nm 陶瓷膜去除固形颗粒杂质，保留截留液和透过液.

1.2.2 云烟精油的柱层析分离处理1)样品的预处理.将截留液M1、透过液M2旋蒸浓缩后，各称取5 g浓缩物，分别加入1.5倍的硅胶粉，混匀，60 ℃条件下烘干.

2)装柱.采用硅胶粉干装法制备长度为 45 cm，直径为5 cm的硅胶柱，将上述烘干后的样品覆盖于硅胶柱上部，再将少许的硅胶粉覆盖于样品之上，最后以棉花覆盖.

3)洗脱.控制洗脱液的流速为10 mL/min，按照如下分段收集洗脱剂及其体积配比依次进行洗脱，V(石油醚)V(乙酸乙酯)=201,101,51,21,11;V(乙酸乙酯)V(石油醚)=13，每组组分均取4个柱体积，以便收集各段不同组分的样品，最后将硅胶柱层析洗脱分离后得到的产物进行旋蒸浓缩.

1.2.3GC-MS分析条件色谱柱：HP-5MS色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气：He；载气流速：3 mL/min；进样口温度：280 ℃；分流比：101；进样量：1 μL；升温程序：起始温度50 ℃,以4 ℃/min 升至280 ℃；离子源：EI源；接口温度：270 ℃；电子能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；采集模式：扫描；质量扫描范围：35～550 amu；检索谱库：NIST11库.

1.2.4 关键香气成分的确定利用SPSS软件进行主成分分析，根据相关系数列出相关矩阵，求出特征值及其相应的特征向量，选出几个较大的特征值及其特征向量，使其累积贡献率在75%以上，并从中筛选出不同组分云烟精油的关键香气物质.

进一步利用ROAV确定样品中挥发性成分对整体风味的贡献程度，计算公式如下：

ROAVi≈(Ci/Cmax×Tmax/Ti)×100

其中，ROAVi为物质i的相对香气活性值；Ci为香气成分的相对质量分数；Ti为香气成分的香气阈值；Cmax与Tmax分别为对样品总体风味贡献最大的组分的相对质量分数和香味阈值.ROAV≥1的香味物质被确定为关键香气成分；0.1≤ROAV≤1 的香味物质被确定为对总体风味有贡献的香气成分.

1.2.5 感官分析将不同洗脱液配比下的流分在45 ℃条件下进行真空浓缩，得到馏分浓缩物(1000 mL洗脱后的馏分浓缩为5 mL左右)，将馏分浓缩物按照体积分数0.2%的比例用香精注射机添加10 μL到未加香加料的空白卷烟中，在温度(22±2) ℃、相对湿度(60±5)%的恒温恒湿箱中平衡24 h后进行感官评吸，将仅加等量乙醇的空白烟作为对照.感官评吸小组从清甜香、木香、花香、干草香、辛香5种香韵评价样品的感官属性，感官特征的强度使用0～9分的等级进行评分，其中0分代表无或不可察觉的强度，9分代表极高的强度.

1.2.6 数据分析以关键香气成分的ROAV作为X变量，以感官属性评分为Y变量进行相关性分析，建立云烟精油关键香气成分与感官属性的PLSR模型，分析云烟精油关键香气成分及感官品质的影响，研究香气成分与感官品质之间的相关性和差异.

2 结果与分析

2.1 云烟精油陶瓷膜分离组分的主成分分析

对截留液和透过液的挥发性成分进行主成分分析(见表1)，分别提取截留液和透过液组分中前3个、前4个主成分，两组组分的累计方差贡献率可分别达到90.715%和78.352%.

表1 截留液和透过液成分特征值及方差贡献率

通过主成分分析，可分别推测出截留液和透过液对香味贡献较大的香味物质，得出两组分关键香气成分之间的差异.表2和表3分别为截留液和透过液的主成分载荷矩阵值.

由表2可知，截留液的第 1 主成分中二氢猕猴桃内酯、3-羟基-β-大马酮、亚麻酸乙酯、癸醛、棕榈酸乙酯，第 2 主成分中巨豆三烯酮、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮，以及第3主成分中苯并噻唑、壬醛的载荷矩阵值较大，均达0.9以上.经主成分分析得出，二氢猕猴桃内酯、3-羟基-β-大马酮、亚麻酸乙酯、癸醛、棕榈酸乙酯、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、巨豆三烯酮、苯并噻唑、壬醛的载荷矩阵值较高，推测这些物质可能为关键香气成分.

表2 截留液主成分载荷矩阵值

由表3可知，透过液的第1主成分中棕榈酸乙酯、亚麻酸乙酯、巨豆三烯酮的载荷矩阵值较大，均达到0.7以上；第2主成分中3-羟基-β-大马酮、第3主成分中的1-己烯以及第4主成分中的柠檬酸三乙酯的主成分载荷矩阵也较大，达0.7以上.经主成分分析得出，棕榈酸乙酯、亚麻酸乙酯、巨豆三烯酮、3-羟基-β-大马酮、1-己烯、柠檬酸三乙酯的载荷矩阵值较高，推测这些物质可能为关键香气成分.

表3 透过液主成分载荷矩阵值

2.2 云烟精油陶瓷膜分离组分的GC-MS分析

表4为不同洗脱液配比下截留液组分的GC-MS分析测试结果.由表4可知，截留液组分中共检测出31种挥发性香味成分，主要包括酯类、醇类、酮类、烯类、烷烃类，其中，3-羟基-β-大马酮、壬醛、3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛、苯并噻唑的ROAV大于1.但是在云烟精油中并不含有苯并噻唑，其可能为柱层析过程中引入的杂质.因此，结合主成分分析和ROAV得出，3-羟基-β-大马酮和壬醛为关键香味物质.

表4 不同洗脱液配比下截留液组分的GC-MS分析测试结果

表5为不同洗脱液配比下透过液组分的GC-MS分析测试结果.由表5可知，透过液组分中共检测出20种挥发性香味成分，主要包括酯类、醇类、酮类、烯类、烷烃类,其中， 3-羟基-β-大马酮、巨豆三烯酮的ROAV大于1，可确定其为关键香味物质.

结合表4和表5可知，与截留液相比，透过液组分中的挥发性成分相对质量分数整体偏低，这可能是截留的悬浮物和微粒吸附了大量脂溶性较好的挥发性成分所致[23-24].

2.3 感官评价结果分析

截留液组分的感官评价结果见表6，感官评价雷达图见图1a).在石油醚与乙酸乙酯配比为11的组分中，清甜香较明显，微有干草香和辛香，这可能是3-羟基-β-大马酮在这些组分中的相对质量分数较高且其ROAV大于1所致；在石油醚与乙酸乙酯配比为201的组分中，花香较明显，稍有干草香和清香，这可能是由于壬醛在该组分的相对质量分数较高且其ROAV大于1所致.

透过液组分的感官评价结果见表6，感官评价雷达图见图1b).在石油醚与乙酸乙酯配比为13的组分中，清甜香较明显，微有花香和干草香，这可能是3-羟基-β-大马酮在该组分中的相对质量分数较高且其ROAV大于1所致，该分析结果与王鹏泽等[25]得出的3-羟基-β-大马酮与清甜香韵呈极显著正相关结果一致.

图1 感官评价雷达图

2.4 云烟精油陶瓷膜分离组分中关键香气成分与感官属性的PLSR分析

图2为关键香气成分与感官属性的PLSR相关性载荷图.由图2a)可知，该模型中有5个感官指标和2个关键香气成分落在2个椭圆(R2=0.75和R2=1)之间，分别代表75%和100%的解释方差，说明该模型能够很好地解释这些指标[26-27].主要呈香成分3-羟基-β-大马酮与清甜香距离较近，壬醛与花香距离较近，说明它们之间的相关性较强.由图2b)可知，有5个感官指标和2个关键香气成分落在2个椭圆(R2=0.75和R2=1)之间，分别代表75%和100%的解释方差，说明该模型具有较好的解释能力.主要呈香成分巨豆三烯酮与与辛香距离较近，3-羟基-β-大马酮与清甜香距离较近，说明它们之间相关性较强.

图2 关键香气成分与感官属性的PLS相关性载荷图

3 结论

本研究采用GC-MS分析云烟精油陶瓷膜分离组分中的香气成分，利用主成分分析筛选出对香气贡献度较大的关键组分，并通过ROAV进一步确定了其关键香气成分：在50 nm 云烟精油陶瓷膜截留液中，有31种不同的挥发性香味物质，其中，3-羟基-β-大马酮、壬醛为关键香气成分，经PLSR分析可知，清甜香与3-羟基-β-大马酮的相关性较强，花香与壬醛的相关性较强；在50 nm云烟精油陶瓷膜透过液中，有23种不同的挥发性香味物质，其中3-羟基-β-大马酮、巨豆三烯酮为关键香气成分，经PLSR分析可知，辛香与巨豆三烯酮的相关性较强，清甜香与3-羟基-β-大马酮的相关性较强.该结论与ROAV分析中所筛查出的关键香气成分相互印证，且所含香韵特征成分及分布与其感官评价结果吻合.