国兰育种技术研究进展

王 玲

（长江大学 园艺园林学院，湖北 荆州 434025）

兰花是兰科植物的总称，被分为5个亚科801属28237种，是单子叶植物中种质最多的一种植物[1]。兰科兰属中的地生种类被称作国兰，主要包括春兰(Cymbidium goeringii(Rchb. f.) Rchb. F.)、蕙兰(C. faberiRolfe)、建兰(C. ensifolium(L.) Sw.)、墨兰(C. sinense(Jackson ex Andr.) Willd.)、寒兰(C. kanranMakino)、莲瓣兰(C. tortisepalumFukuyama)、春剑(C. tortisepalumvar.longibracteatum(Y.S.Wu & S.C.Chen) S.C.Chen & Z.J.Liu)等，在我国有2000多年的栽培历史。国兰叶片飘逸挺拔，花朵秀丽高雅，幽香沁人心脾，在我国大江南北、海峡两岸以及受中国文化影响的国家和地区都被广泛追捧[2]。近年来，兰花在年宵花市场上越来越受欢迎，国兰凭其沁人的幽香，飘逸的姿态也在年宵花市场中占得一席之地。与洋兰的工厂化、产业化相比，国兰工厂化生产困难，其育种与繁殖技术较为落后。因此，国兰育种技术的开发对于国兰经济价值的开发至关重要。本文将从国兰种质资源的收集、种质资源的鉴定、杂交育种、组织培养、多倍体育种、分子育种等方面介绍国兰育种研究进展及其发展趋势，并提出展望，以期为国兰的新品种选育和产业化栽培提供理论依据。

1 国兰种质资源的收集

种质资源是新品种选育和产业化栽培的基础。国兰在我国种植历史悠久，种质资源十分丰富。20世纪90年代，“兰花热”开始兴起，不少野生兰花被过度采挖，生存地被大肆破坏，使得国兰种质资源受到严重威胁[3]。20世纪90年代末国家开始重视兰花种质资源的保护，并将兰花列入植物保护名录，其中，1999年春兰被列入《中华人民共和国农业植物新品种保护名录(第一批)》，2001年兰属被列入《中华人民共和国农业植物新品种保护名录(第三批)》，2021年新颁布的《国家重点保护野生植物名录》第二批中兰科兰属的植物除兔耳兰(C. lancifoliumHook.)外全部被列为国家重点保护野生植物。此外，兰圃公园与兰花种质资源库等的建立也为国兰种质资源的收集与保护起到了重要作用。广州的兰圃公园自1951年建成一直致力于兰花的种质资源的迁地保护，共保存兰花种质资源15属113种，其中国兰有81种[4]。湖南省园艺研究所国家蕙兰种质资源库2010年10月开始从事蕙兰种质资源收集和研发，截至目前，已从湖南、湖北、贵州、福建等地引种和保存不同类型的蕙兰种质资源1000余份，其中梅瓣资源80份，荷瓣资源90份，叶艺资源50份，奇花资源25份[5]。随着国家的重视及人们保护意识的提高，近年来国兰野生资源逐渐得到恢复，这对国兰优良种质资源的收集、利用和开发十分有利。

2 国兰种质资源的鉴定

兰花亲本的选择直接关系到兰花优良品种的选育，种质资源的鉴定有助于快速找到性状好且杂交率高的亲本，对于国兰的育种具有重要意义。国兰为典型的虫媒花，种子结实自然变异率高[6]，多年来的人工育种在丰富了国兰品种的同时也使许多国兰杂交品种遗传背景复杂，导致国兰的种质资源鉴定变得十分困难。表型形态标记是利用物种表型特征进行分类的方法，其主要特点为简便易行。傅巧娟等[7]通过对62份建兰种质表型进行分析，发现建兰种质表型多样性丰富，经过综合评价，发现‘四季红荷’表现最优。虽然传统的形态学分类能在一定程度上对国兰种质进行鉴定，但存在一定局限性。

分子标记技术是用于植物分类、鉴别的常用手段，能够精确、快速鉴定物种之间的亲缘关系。前人通过对5种国兰的38个品种进行ISSR分子标记分析，根据聚类结果，选择遗传相似系数不同的亲本进行杂交。结果表明，遗传相似系数较低的国兰亲本人工授粉后，未长出成形的蒴果；而遗传相似系数较高的国兰亲本经授粉后均长出了成形的蒴果，证明了利用ISSR分子标记技术辅助国兰育种的可行性[8]。唐源江等[9]用SRAP标记对华南及邻近地区的139份国兰栽培品种和野生种质进行分析，并将国兰种质分为4组：一为春兰组，由春兰种质单独构成；二为建墨兰组，主要由建兰和墨兰种质组成；三为寒蕙兰组，主要由寒兰、蕙兰和其杂交系组成；四为剑莲兰组，由春剑和莲瓣兰种质组成。通过聚类分析表明剑莲兰组与寒蕙兰组亲缘关系最近，与建墨兰组次之，与春兰组亲缘关系较远。而利用叶绿体基因组非编码区序列作为DNA条形码对春兰、蕙兰、建兰、寒兰和墨兰等5种国兰的亲缘关系进行分析时，发现寒兰与墨兰的亲缘关系最近，其次为建兰，春兰和蕙兰单独聚为一支[10]。此外，李丽辉等[11]利用RAPD和ISSR分子标记技术，对7种国兰的21个品种资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，研究结果表明国兰品种间的亲缘关系与地理位置分布相关。以上鉴定结果为国兰育种亲本的选择奠定了理论基础。

3 国兰杂交育种的研究

兰花是典型的虫媒花，在自然状态下无法自己授粉，需借助特定的昆虫进行授粉。兰科植物种子细小如尘，发育不完全，仅具尚未分化的原胚，自然条件下需与合适的菌根真菌共生才能萌发[12]。国兰杂交育种通过人为地将拥有优良性状的国兰亲本进行人工授粉，再结合种子无菌萌发选育性状优良、稳定的后代，是目前国兰育种的主要手段。

国兰杂交育种分为种内、种间和属间杂交育种。由于国兰在自然条件下易产生变异，每个种类都有许多不同的品种，品种之间有时存在巨大差异，利用不同品种进行杂交能够选育出优良的新品种，如春兰杂交新品种‘宋蝴蝶’、‘大宋梅’、‘福娃梅’、‘赛牡丹’等就是通过种内杂交选育而来[3]。此外，在种内杂交育种的研究中，王俊萍等[13]通过将不同的春兰进行种内杂交，进而探究春兰遗传规律及蒴果生长过程。结果发现成果率与花粉受精后栽培养护的关系很大，幼果在受精后40 d左右容易受损；研究进一步发现8—9月是春兰杂交育种的关键期，在这个时期，春兰植物易染病导致蒴果夭折。种间杂交育种是国兰杂交育种的重要方法。2010年《散氏兰花新杂种登记目录》公布的以6种国兰直接为亲本进行种间杂交所获得登录的杂交种有224个，其中墨兰有86个，建兰有57个，春兰有56个，寒兰有14个，蕙兰有10个，莲瓣兰有1个[14]。福建省林业科技试验中心的李秀娟以建兰‘冠年’为父本、莲瓣兰‘白雪公主’为母本，选育出了兰花新品种‘玉女丹心’[15]。大花蕙兰(C. faberi × hybridum)是兰属植物通过人工杂交培育出的品种统称[16]，具有植株强健、花大花多、花色艳丽、花期长等优点[17]，常作为国兰种间杂交育种的重要亲本。将大花蕙兰与国兰品种的优良性状相结合，有望培育出花大色艳、株型紧凑美观且极具幽香的兰花新品种[18]。‘韩国桃花’为大花蕙兰与墨兰杂交获得的杂交兰，花中型、色艳、清香、雅致，集大花蕙兰的花大、色艳、花期长及国兰的幽香、典雅和韵味为一体，具有很高的观赏价值和市场前景[19]。关于国兰属间杂交的研究较少，张志胜等[20]以墨兰为母本，蝴蝶兰和文心兰为父本杂交不结果，而以建兰为母本，蝴蝶兰为父本进行属间杂交时，结实率极低，这说明国兰属间杂交育种还需解决属间遗传不亲和性的问题。

近年来，围绕着国兰杂交育种影响因素的研究开展了大量的研究。其中，花粉活力与柱头可授性是杂交育种的重要依据。杨小丹等[21]探究了花粉活力与柱头可授性对国兰杂交结荚率影响，发现国兰花朵开放后0～20 d的花粉活力处于增长期，之后花粉活力随花朵开放时间的增加而降低。此外，花朵开放相同天数的不同国兰品种间的花粉活力差异较大。对于兰花柱头可授性而言，大花蕙兰花朵开放后20～25 d时柱头都具可授性，不同品种间有差异。花粉活力、柱头可授性的强弱对结荚率有一定的影响，一般表现为花粉活力与柱头可授性越强结荚率越高。

亲本的选择是杂交育种能否成功的重要依据。傅巧娟等[22]对春剑、春兰、墨兰、蕙兰、大花蕙兰和杂交兰进行不同组合的杂交实验，发现国兰种间杂交结实率较高，国兰与大花蕙兰杂交结实性明显较低。不同杂交组合正反交结实性差异明显，以大花蕙兰为母本的杂交组合，其结实率极低或未结实，但反交时均有不同程度结实，同一杂交类型不同杂交组合间结实性也存在较大区别。此外，李玉萍等[23]将3个国兰品种和2个大花蕙兰品种进行了不同组合的杂交实验，发现以春兰‘绿萼’为母本，以大花蕙兰‘月影’为父本时杂交效率较高，其杂交后子房膨大率为100%，结果率为90%。目前国内关于国兰杂交育种的研究不少，但大都停留在亲本杂交结实率、杂交种子的萌发及组培体系的建立上，加上杂交育种所需时间长，杂交后代性状没有可预见性，导致真正通过杂交育种选育出具有可推广性、性状优良的杂交种较少。

4 国兰组织培养技术的研究

组织培养作为植物无性繁殖的常用手段，是单倍体育种、多倍体育种、分子育种等的必要环节，对于国兰的育种具有重要意义。关于兰花组培的研究主要有两个方面，一是通过组织培养使种子无菌播种萌发获得无菌苗，二是茎尖、侧芽、腋芽、花芽等外植体的离体培养[24]。1920年Knudosn发现可将兰花种子用无菌发芽法获得幼苗，这对兰花栽培起到了极大的作用，而后1960年Morel以大花蕙兰茎尖为外植体诱导形成原球茎并分化成完整植株，自此组织培养技术逐步在兰花生产中广泛应用[25]。

国兰组织培养技术的研究起步相对较晚，1973年中国科学院上海植物生理研究所利用组织培养技术成功获得建兰的无菌植株[26]，此后逐步建立了寒兰、墨兰、春兰、蕙兰等国兰的组培体系。在国兰种子的无菌培养中，刘祥[27]以春兰和墨兰的杂交种子为材料，成功获得了质量性状优良的杂种幼苗。而苏妍[28]以寒兰和建兰所得种子为材料，成功的建立了寒兰和建兰种子萌发的组培体系，具体培养基配方为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+2.0 g/L蛋白胨+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂。此外，付秀芹等[29]等以蕙兰种子为材料探究蕙兰组培快繁体系，表明蕙兰种子萌发最佳培养基为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭。在国兰外植体离体培养中，张天翔[30]以寒兰茎尖为外植体，建立了寒兰的组培快繁体系，移栽成活率可达93.33%。

国兰及其杂交种的中间繁殖体有根状茎和原球茎或类原球茎两种类型，中间繁殖体的增殖与分化是国兰工厂化繁殖的关键，目前国兰组织培养中关于中间繁殖体的研究较多。其中，苏妍[28]和付秀芹等[29]等分别建立了寒兰和建兰以及蕙兰的根状茎增殖培养、根状茎分化的组培体系。而龙蔷宇等[31]等针对培养基配方对杂交国兰根状茎分化的影响进行了系统的研究。此外，谢娟等[32]等的研究结果表明适宜杂交墨兰根状茎增殖的培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L TDZ+1.5 g/L活性炭+35.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂。吴正景等[33]和姚金澳等[34]分别经研究发现在培养基中添加100 mL/L的椰汁或100 g/L香蕉泥能够显著提高根状茎增殖和分化效率。

国兰组织培养现在虽已取得了一定进展，但其中还存在许多问题，如种子萌发率低、污染率高、外植体褐化严重、增殖分化及移栽困难等。近年来，围绕着这些不足开展了大量的研究，取得了长足的进展。其中，罗尚华[35]发现不同的外植体耐消毒剂的能力不同，如在培育蕙兰种子的过程中，75%乙醇45 s+0.1%升汞消毒8 min的效果最佳，而在培育春兰新芽的过程中，75%乙醇45 s+0.1%升汞消毒5 min的消毒效果最佳。此外，李菲菲等[36]认为兰花外植体材料的基因型对褐变的发生频率、程度都存在着关键影响，不同种类的兰花之间褐化程度差异很大。在国兰组培过程中，为减轻褐化现象，应选取褐变较轻的种类或品种，对材料进行消毒、冲洗、热烫（或热激）、抗褐化剂浸泡等预处理。并且，通过在培养初期进行暗培养，培养基中加入柠檬酸、抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮和活性炭等抗褐化剂，以及勤换瓶和切除愈伤组织褐变部分等措施能够显著提高国兰的组培效率。

5 国兰多倍体育种的研究

多倍体育种是植物育种的重要方法。多倍体植物具有植株粗壮、花朵硕大、花色艳丽、叶质增宽增厚、适应性增强及次生代谢物积累量高等特点[37]。多倍体诱导的主要途径有物理诱导、化学诱导和2n配子途径[38]。在国兰的多倍体育种中，应用方法最多的是化学诱导法。国兰的多倍体育种是通过化学诱变剂对材料进行处理并结合组织培养从而诱导国兰多倍体的形成，其中，秋水仙素是最常用的化学诱变剂。在国兰的多倍体育种中，秋水仙素的处理浓度和处理时间根据材料的不同和处理的方式而异，其中，处理方式主要分为浸泡法和混培法。王木桂等[39]采用混培法系统的研究了秋水仙素处理时间和处理浓度对墨兰‘企剑白墨’多倍体诱导效率的影响，研究结果发现0.01%秋水仙素诱导3 d的效果最佳。并且通过表型分析发现诱导出的四倍体比二倍体更加粗壮，顶端更圆，四倍体植株株型紧凑，叶片质地变硬，根明显增粗。而宋莲等[40]发现杂交兰原球茎在0.03%秋水仙素中浸泡72 h的诱导效率最佳。秋水仙素毒性大且价格昂贵，因此寻找一种毒性小成本低的化学诱导剂来开发国兰的多倍体诱导育种是亟待解决的问题。李涵等[41]以‘黄金小神童’根状茎为材料，采用安磺灵和甲基磺酸乙酯(EMS)两种诱导剂进行多倍体诱导，发现根状茎经过0.002%的安磺灵中浸泡48 h后转入含有50 mg/L EMS的固体培养基中培养诱导效果最佳，其多倍体诱导率为52%，诱导出的四倍体株系表现出植株粗壮，叶片增厚带革质、叶色深绿、叶片扭曲等特征。

兰花在减数分裂过程中会产生2n配子，因此可以利用2n配子与正常配子受精进行多倍体育种。在此基础上，徐仕英[42]对不同杂交兰的2n雄配子发生率进行了研究并进行杂交实验，发现有性三倍体杂交兰在株宽、花朵数、株高、假鳞茎直径、叶片数等方面显著高于其对照组二倍体兰花。多倍体育种作为国兰育种的一种新型方式，拥有巨大的开发潜力。但国兰多倍体育种目前还存在许多问题，如诱变剂浓度难以掌握、嵌合体现象和植株生长缓慢等。2n配子途径通过将多倍体育种与传统杂交育种相结合，可以有效获得国兰多倍体植株。在今后的研究中，可以通过寻找易产生2n配子的亲本与其它亲本进行杂交进而选育性状优良的多倍体国兰。

6 国兰分子育种的研究

花朵是兰花观赏价值的主要来源之一。近年来，围绕着国兰花朵开展了大量的研究，主要包括花型、花香等多种性状。MADS-box家族基因是已报道的影响植物花器官发育的关键调控因子[43]。在国兰中，Sun等[44]对蕙兰转录组数据进行分析，在转录组水平共鉴定出34个MADS-box基因，并发现在这些MADS-box基因中，至少有28个参与了蕙兰开花时间的调控。田云芳等[45]从春兰中克隆了APETALA1-like(AP1)基因，并指出该基因参与了花器官萼片的形成，可能参与了开花时间的调控。Fei等[46]从蕙兰中分离出B类PISTILLATA(PI)基因，通过qPCR分析发现该基因在花被和合蕊柱中表达量最高。通过在拟南芥pi-1突变体中异源表达该基因完全恢复突变体花瓣的发育，部分恢复雄蕊的发育，证明了CyfaPI基因在蕙兰花被和合蕊柱发育中的关键作用。此外，夏胜应[47]从春兰中分离了2个C类MADS-box家族基因CygoAG1与CygoAG2，进一步研究证实了这两个基因的组织表达特异性，说明了它们在调控花器官发育的潜在功能。在国兰花香、叶色等性状的研究中，周银等[48]发现CfAOC基因的表达可能与蕙兰花香合成有关。张晓莹等[49]对杂交兰的叶色进行转录组测序和表型分析，鉴定了参与兰花叶色形成的NAC、MYB和bHLH等调控因子。此外，李玉霞等[50]克隆了蕙兰CIN同源基因CfCIN，并通过异源表达证实CfCIN参与了叶片的形态建成。以上这些研究为利用分子育种手段进行国兰观赏价值的开发奠定了基因资源和理论基础。但由于国兰缺乏高效的转基因体系，导致国兰分子育种进展缓慢。这主要是兰科植物对农杆菌不敏感，且在遗传转化过程中缺乏合适的表达载体[51-52]。在此基础上，孔凡龙[53]初步建立了一套适合于春兰的遗传转化体系，转基因植株经过GUS染色和PCR检测，证明GUS基因已成功整合到春兰的基因组中。此外，Tong等[54]建立了蝴蝶兰的CRISPR-Cas9基因编辑体系，并通过该体系成功获得了蝴蝶兰MADS44、MADS36和MADS8的突变株系。尽管如此，但目前利用转基因技术对国兰进行品种改良的研究还少有报道。

7 问题与展望

国兰的育种工作目前还主要以传统育种为主，包括驯化育种、杂交育种等，但这些育种方式存在着育种时限长、杂交后代性状不可预测、对国兰种质资源有破坏性等问题，这在一定程度上制约了国兰育种的发展。随着基因组大数据时代的来临，分子育种在育种技术中所占比例越来越重，利用转基因技术和基因编辑技术对国兰叶型、叶色、花香、花色以及花型等进行遗传改良将成为育种发展的重要方向。我国国兰种质资源丰富，将现有种质资源进行收集并采用分子标记等技术进行种质鉴定，利用分子育种等现代育种方式对现有种质进行性状改良，并结合组织培养技术使其实现快速繁殖必将成为国兰实现产业化、商品化的新趋势。