莲腐败病菌pg基因的克隆及真核表达分析

龚 鑫，石绪根，孙晓棠，郑兴汶，杨良波，崔汝强*

（1.江西农业大学 农学院，江西 南昌330045；2.江西省广昌县白莲产业发展局，江西 广昌344900）

近年来莲腐败病的发生面积快速增加，尤其是长时间的连作导致土传病原真菌逐渐积累，莲腐败病发生日益严重[1]。目前该病害很难通过农事操作及化学防治达到有效控制，已经成为莲生产中的一种重要制约因素。在江西，白莲主产区每年约有30%～70%的莲田发生莲腐败病，其中有10%～15%的莲田发病严重，甚至颗粒无收[2-3]。实验室通过分离病原物和体外接种实验证实，江西省广昌县莲腐败病的病原菌为尖孢镰刀菌莲专化型（Fusarium oxysporumf.sp.nelumbicola）[2]。发病初期，莲叶从叶缘处开始出现褐色病斑后逐渐向内扩展，后期叶片枯萎死亡，甚至整株枯死。

植物细胞壁是抵御病原菌侵入的主要屏障。病原菌通过分泌一系列的细胞壁降解酶降解寄主细胞壁，突破屏障入侵寄主植物[4]。在细菌、真菌和植物中广泛存在的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是一种重要的细胞壁降解酶，通过降解植物细胞壁中的同源多聚半乳糖醛酸，引起植物组织浸解进而导致原生质体死亡[5]，在病原菌侵染寄主引起病害过程中起着关键作用[6-7]。本实验室证实莲腐败病菌在侵染致病过程中能够产生多种细胞壁降解酶，其中PG活性最高，且强致病性菌株的PG活性显著高于弱致病性菌株[3]，说明菌株致病力与PG酶活性密切相关，PG是重要的致病因子。本研究克隆了莲腐败病菌PG基因，并通过构建原核表达载体以期进一步分析PG基因的功能，探讨该基因在病原菌浸染过程中的作用机理，为莲腐败病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

莲腐败病菌（F.oxysporumf.sp.nelumbicola）为本实验室分离鉴定并保存的菌种。挑取莲腐败病菌菌株于PSA 平板上28 ℃培养5～6 d 保存备用。

1.2 RNA 提取与cDNA 第一链合成

利用GeneMark RNA提取试剂盒提取莲腐败病菌总RNA。根据TAKARA RNA PCR Kit合成cDNA[8]。

1.3 pg1 基因的克隆

以反转录的cDNA为模板，pg1F和pg1R为引物扩增目的基因pg1，目的基因PCR产物连接至载体pMD18-T后，送上海祥音科技公司测序[9]。

1.4 莲腐败病菌pg1基因酵母表达载体的构建及表达分析

1.4.1 载体构建以获得的全长阳性克隆质粒为模板，用Not I及Xho I内切酶双酶切pPICZαA空载体和质粒37 ℃过夜。用T4连接酶16 ℃过夜连接获得目的基因和空载体片段，然后转化感受态大肠杆菌DH5α，于37 ℃培养12 h，挑单克隆进行PCR检测，检测为阳性的克隆送上海祥音科技公司测序[10]。

1.4.2 酵母转化子的筛选和鉴定根据分子克隆中酵母菌的感受态细胞制备方法制备毕赤酵母SMD1168感受态细胞，并将重组载体pPICZαA-pg1通过电转化法转入酵母感受态中，于30 ℃环境下静置培养24 h，利用筛选培养基筛选转化子，PCR方法检测筛选阳性克隆，并送上海祥音生物技术有限公司测序鉴定[11]。

1.4.3 酵母诱导表达鉴定取经PCR鉴定为阳性克隆的转化子接种在BMGY培养液中振荡培养至OD值为2.6，离心弃上清液。沉淀加BMMY培养液重悬细胞振荡培养，每24 h补充甲醇连续诱导3 d，每24 h取菌液用于10%SDS-PAGE分析[11]。

1.5 重组蛋白Western blot

Western blot 方法参照文献[11]提供的方法，采用BIO-RID 半干转膜仪转膜，采用Abcam 公司直标抗体Anti-c-Myc（HRP）进行标记。

1.6 生物信息学分析

用BioXM 软件(Ver.2.6) 预测LbMYB1 蛋白分子量和等电点，用Clustalx(Ver.1.83) 和BioEdit 软件(Ver.7.1.3) 进行多序列比对，用MEGA4.0.2 软件进行系统发育分析[12]。

2 结果与分析

2.1 RNA提取结果

利用GeneMark RNA提取试剂盒提取莲腐败病菌总RNA，电泳结果如图1所示。

2.2 pg1基因的扩增

从GeneBank的镰刀菌数据库中下载pg1基因序列，利用Clustalx软件进行多序列相似性比对，发现该基因在起始密码子和终止密码子位置附近具有较高的同源性，故在包含起始密码子和终止密码子的位置设计了pg1特异性全长引物并加入Not I及Xho I的酶切位点。

pg1F：5′-ctcgagaaaagaATGTTCTCTTCAACTGTCCTTCTC-3′，

pg1R：5′-gcggccgcGCAAGAGGCACCAGAGGG-3′

图1 RNA 电泳

以cDNA 为模版，利用引物pg1F/pg1R 在不同退火温度条件下扩增pg1，在电泳图谱上得到一条大小约为1 100 bp 的目的条带，符合预期片段大小（图2）。将目的基因cDNA 全长连接到克隆载体pEASY-Blunt Simple 上，对阳性克隆载体进行挑斑鉴定。阳性克隆测序结果表明，pg1 基因包含完整的开放阅读框1 113 bp，推测编码了371 个氨基酸（GenBank No.MF563874）。预测的信号肽序列为MVRNIAALLPAAFAS。编码的氨基酸序列分子量大小38 451.7 ku，理论等电点6.36，有27个带负电荷的残基（Asp+Glu），25 个带正电荷的残基（Arg+Lys）。分子式为C1668H2635N465O554S12，含有原子总数5 334 个。脂肪系数为78.54，疏水平均值为-0.165。不稳定系数为21.19，推测该蛋白为稳定的蛋白。

2.3 PG同工酶基因的系谱分析

从GeneBank 上下载目前已克隆的尖孢镰刀菌PG同工酶基因序列，利用Clustalx 和BioEdit 软件进行多序列比对，利用MEGA4.0.2 软件构建本实验获得的莲腐败病菌尖孢镰刀菌莲专化型及其它尖孢镰刀菌的PG 同工酶基因系统发育进化树。结果显示pg1 与尖孢镰刀菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因的亲缘关系较近，具有Glyco-hydro-28 家族的保守区域的结合位点，如图3所示。

图2 不同退火温度条件下pg1 的扩增结果

图3 PG同工酶基因的氨基酸比对及系统进化树分析

2.4 转化子的诱导表达及Western blot分析

将阳性克隆先后接种在BMGY 和BMMY 培养基中培养，后加甲醇诱导3 d。利用SDS-PAGE 和Western blot 鉴定。结果表明，pPICZαA-pg1 目的蛋白约为38 ku，与预测蛋白分子量大小相当（图4）。

图4 重组蛋白表达产物的Western blot 分析

3 结论与讨论

研究表明，多数真菌的PG是由多基因编码[13]。根据降解半乳糖醛酸的方式不同，可分为内切型（endoPG）和外切型（exoPG）两种。endoPG能降解细胞组织引起细胞死亡[14]，而且产生的寡聚半乳糖醛酸是激发植物防卫反应的激发子[15]。exoPG能降解由endoPG产生的激发子物质，并转变为其它细胞壁降解酶的诱导剂[16]。序列分析发现真菌PG有11 个完全保守的芳香族的氨基酸残基，endoPG和exoPG还有各自特异保守片段和残基。这种结构上的高度保守性，为更多地克隆和研究植物病原真菌PG基因的功能提供了途径[17]。

目前已从不同属的病原真菌中克隆了多个endoPG基因。氯氮卓青霉菌（Penicillium solitum）的PG在病原菌侵染寄主的前期起着重要作用[18]，辣椒疫霉（P.capsici）PG体外重组蛋白能侵染辣椒表现症状[19]；链格孢菌（Alternaria citr）endoPG突变降低了对柑橘和马铃薯的致病力[20]，灰葡萄孢Bcpg1 的缺失导致其在不同寄主上的致病力下降[21]、麦角菌（Claviceps purpurea）endoPG 失活，对黑麦几乎丧失了致病力[22]。侵染柑橘果实的链格孢菌（A.alternata）[23]、侵染美洲栗的球丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)[23]、侵染玉米的旋孢腔菌（Cochliobolus carbonum）[24]的PG基因敲除或失活，对病原菌致病性没有影响。目前已从尖孢镰刀菌甜瓜转化型F.oxysporumf.sp.melonis中克隆了pg1 基因[25]，从番茄专化型F.oxysporum.f.sp.lycopersici（FOL）中克隆了pg5[26]两种endoPG 基因，但单独缺失FOM pg1 和FOLpg5 对病原菌致病力均没有影响。尖孢镰刀菌有150 多个寄主专化型，而据报道，PG的进化源于生态对策，是与植物的免疫反应协同进化的[27]。不同专化型在与寄主长期协同进化的过程中，PG基因会不会在表达和功能上存在不同，尚不清楚。本研究克隆了莲腐败病菌PG基因，并通过构建原核表达载体，以期为进一步分析PG基因的功能，探讨该基因在病原菌浸染过程中的作用机理及莲腐败病的防治提供科学依据。