生牛乳中芽孢杆菌的分离鉴定及其耐热性

侯霞霞，王云霞，刘丽君，李翠枝，吕志勇

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

芽孢杆菌是一类在高温、干燥、辐射或营养物质缺乏等特定条件下能形成内生孢子的细菌[1-2]，形成的芽孢具有极强的耐受性，这类菌广泛存在于土壤、牛舍、饲草等奶牛生活环境中，而生牛乳因其丰富的营养条件，成为芽孢杆菌天然的培养基[3-4]。因此，生牛乳中经常会检出部分芽孢杆菌，生乳经巴氏杀菌和超高温瞬时灭菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）杀菌后会有少量芽孢残留，后期在适宜的条件下会大量繁殖为营养体细胞，生乳中芽孢杆菌的多少、种类直接影响牛乳后期的质量[5-8]。同时，芽孢杆菌还可以产生脂肪酶和蛋白酶，能分解牛乳中的脂肪和蛋白质，造成牛乳结块、产生苦味、脂肪上浮，使牛乳变质，严重影响产品品质和货架期[9-12]。芽孢杆菌形成的芽孢体对于极端环境有极强的耐受性，乳制品生产过程中，经UHT后生乳中的芽孢不能被完全杀灭，尤其是需氧芽孢和嗜热需氧芽孢杀灭率最差[13]。目前，需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌的分离主要采用热处理法[14]，由于芽孢杆菌在较高温度处理时可以形成耐热的芽孢，后通过适宜的条件使芽孢重新萌发，而其他细菌因不耐受高温死亡，因此可以分离到芽孢杆菌。对于芽孢杆菌的鉴定方法目前有很多，如传统形态学鉴定[15]、生理生化鉴定[16-17]及基于核酸序列测定的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法[18-19]等，本研究旨在对生牛乳中的需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌进行分离，通过采集并选择含有芽孢杆菌的生牛乳样品，参考NY/T 1331—2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》[20]进行需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌的分离，对分离的菌株通过形态学、生理生化和分子生物学多种手段进行鉴定，最终确定其种属，同时研究嗜热需氧芽孢杆菌的耐热性，为生牛乳中芽孢杆菌的控制以及减少因芽孢杆菌引起的乳制品质量问题提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生牛乳样品采集于北方及东北地区A、B、C 3 个牧场，共30 份样品，每个牧场10 份样品，每份采样量≥1 000 g。

葡萄糖胰蛋白胨琼脂（DTA培养基）、乳平板计数琼脂（MPC培养基）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA培养基） 北京陆桥技术股份有限公司；革兰氏染色液青岛海博生物技术有限公司；BCL芽孢杆菌鉴定卡法国生物梅里埃公司；细菌基因组DNA小量提取试剂盒上海莱枫生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1389生物安全柜、涡旋振荡器 美国Thermo Fisher Scientific公司；SPX-250II生化培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；GI54DWS高压灭菌锅 厦门致微仪器有限公司；DK-2000-IIIL电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器公司；H22-X3电陶炉 杭州九阳生活电器有限公司；VITEK2 COMPACT全自动微生物鉴定系统法国生物梅里埃公司；Axio Lab.A1生物显微镜 卡尔蔡司光学（中国）有限公司；G1000 PCR仪 杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢杆菌的分离

1.3.1.1 需氧芽孢菌株的分离

取装有5 mL生牛乳样品的试管，放入80 ℃水浴中，使试管内液面至少低于水面4 cm，加热处理10 min。取对照管，加入与样液等量的水并测定温度。试管内样液的升温时间不应超过5 min。将加热处理后样液试管取出立即放到20 ℃以下的流水中冷却。用1 mL无菌吸管吸取1 mL经加热处理的样液，于含有9 mL无菌磷酸盐缓冲液稀释液的试管中，振摇试管，混合均匀，获得其10 倍稀释液，根据对样品中芽孢含量的估计，选择2～3 个稀释度，分别取1 mL样品悬液以3∶3∶4（V/V）各加入3 块提前配制好的MPC培养基平板，用L型涂布棒均匀涂布至表面干燥，倒置在培养箱中，于36 ℃培养48 h后计数[20]。

1.3.1.2 嗜热需氧芽孢菌株的分离

取装有5 mL生牛乳样品的试管，放入100 ℃沸水浴中，使试管内液面至少低于水面4 cm，加热处理30 min。在对照管中加入与样液等量的水并放1 支温度计测定温度。试管内样液的升温时间不应超过5 min。将加热处理后样液试管取出立即放到20 ℃以下的流水中冷却。分别取1 mL冷却后的生牛乳样液以3∶3∶4（V/V）分别加入3 块提前配制好的DTA培养基平板，用L型涂布棒均匀涂布至表面干燥，倒置在培养箱中，于55 ℃培养48 h后计数[20]。

1.3.2 芽孢杆菌的纯化

挑取MPC培养基上不同形态特征的菌落分别划线于TSA平板，于36 ℃培养24 h。挑取DTA培养基上不同形态特征的菌落分别划线于TSA平板，于55 ℃培养24 h。可获得芽孢杆菌纯菌株。

1.3.3 芽孢杆菌的鉴定

1.3.3.1 形态学鉴定

将纯化后的需氧芽孢杆菌于TSA培养基划线，36 ℃培养24 h，将纯化后的嗜热需氧芽孢杆菌于TSA培养基划线，55 ℃培养24 h，观察记录菌落形态，取典型菌落涂片，并进行革兰氏染色后通过光学显微镜进行菌体形态和芽孢位置观察。

1.3.3.2 生理生化鉴定

挑取革兰氏阳性、具芽孢的单一纯菌落于0.45 g/100 mL NaCl溶液中制备菌悬液，调节麦氏浊度至1.8～2.1，通过全自动微生物鉴定系统利用BCL卡进行鉴定，15～18 h仪器自动给出鉴定结果。

1.3.3.3 16S rDNA序列分析

通过细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取芽孢杆菌纯菌株DNA，利用细菌通用引物进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃预变性2 min；30 个循环：94 ℃变性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸1.5 min；72 ℃终延伸10 min后4 ℃保存。将扩增产物外送上海生物工程股份有限公司测序，将测得的16S rDNA序列结果利用在线分析网站NCBI或EzBioCloud进行比对分析，获得与已知序列微生物的相似性，选取与鉴定序列相似度≥99%且相似度最高的种结果来确定芽孢杆菌的种属信息。同时，构建系统进化树，进化距离采用Kimura 2-parameter法计算，进化树构建由MEGA7软件完成[21-22]。

1.3.4 嗜热需氧芽孢菌株的耐热性实验

准备同批次UHT乳，检测无菌后备用，实验同时设置空白对照。以5%的接种量接种1.3.1.2节中分离的芽孢菌液于100 mL无菌UHT乳，置于36 ℃培养箱保温增菌。3 d后分别取牛乳培养物测定芽孢菌数，将达到105CFU/mL且牛乳组织状态良好的样品作为耐热性实验初始待测样品。研究芽孢菌在不同温度条件（80 ℃/10 min、90 ℃/10 min、100 ℃/10 min、100 ℃/30 min、115 ℃/20 min、121 ℃/20 min）下的耐受性。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离和纯化结果

本研究参考NY/T 1331—2007进行需氧芽孢菌株和嗜热需氧芽孢菌株的分离和计数，为方便后续纯化时挑取单菌落，用平板涂布法代替倾注法，30 份生牛乳样品分别进行计数，然后从不同生牛乳样品DTA和MPC计数平板上挑取菌落形态不同的菌株并纯化获得10 株芽孢杆菌，需氧芽孢杆菌分别编号为yb-1、yb-2、yb-3、yb-4、yb-5、yb-6、yb-7，嗜热需氧芽孢杆菌分别编号为sr-1、sr-2、sr-3。

2.2 芽孢杆菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定结果

芽孢杆菌的形态特征包括菌体形态和菌落形态特征。在TSA平板上，分离菌株菌落较大，白色至浅棕色、多数不透明且表面有褶皱，部分边缘不规则。挑取TSA平板上生长的单个纯菌落进行革兰氏染色镜检，分离菌株革兰氏染色均为阳性、杆菌、单个或链状，具中生或端生芽孢，大部分菌株孢囊不膨大，各菌株革兰氏染色结果见图1。从生物学特性来看，需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌的菌落特征相似，菌落较普通细菌稍大，但生长温度不同，需氧芽孢杆菌可在36 ℃生长，而嗜热需氧芽孢杆菌在55 ℃才能较好生长。在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径。能否形成芽孢及芽孢的形状、芽孢在孢囊的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌中芽孢杆菌的重要依据之一。分离菌株的具体形态特征见表1。

图1 10 株芽孢杆菌革兰氏染色照片（×1 000）Fig.1 Observation of 10 Bacillus strains based on Gram staining (× 1 000)

表1 芽孢杆菌菌体形态和菌落特征Table 1 Morphological characteristics of cells and colonies of Bacillus

2.2.2 生理生化和16S rDNA鉴定结果

由表2可知，生牛乳中的芽孢杆菌主要有蜡样芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、明胶芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌，其相似度均达到90%以上。由于细菌的生理生化特征受培养物活性、传代次数、培养基及培养条件的影响常常具有可变性，因此，还需结合细菌的菌落形态和菌体形态以及分子生物学特性来综合判断其分类地位。16S rRNA在细菌的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”[23-24]。为更科学、精准地确定分离菌株的种属地位，利用16S rDNA测序方法对分离到的10 株芽孢杆菌进行鉴定，将测序结果在GenBank进行比对，选取与待测菌株相似度较高的序列，采用邻接法构建系统进化树，由图2可知，16S rDNA鉴定结果与VITEK2鉴定结果一致。结合形态学、生理生化和分子生物学鉴定结果综合得出，生牛乳样品中分离到的10 株菌分别为蜡样芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、明胶芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌，其中2 株地衣芽孢杆菌聚为一支，但稍有差异，后续可以通过全基因组测序对其进一步研究。

表2 10 株芽孢杆菌生理生化和16S rDNA鉴定结果Table 2 Results of identification of 10 strains of Bacillus based on physiological characteristics, biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence

图2 分离菌株基于16S rDNA序列的进化树Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rDNA gene sequences

2.3 不同牧场生牛乳样品芽孢杆菌检出数量及种类

生牛乳样品经80 ℃/10 min处理后，检出的为需氧芽孢杆菌，经100 ℃/30 min处理后，检出的为嗜热需氧芽孢杆菌。由表3可知，A、B、C 3 个不同牧场均有需氧芽孢杆菌检出，需氧芽孢杆菌检出率较高，达到57%，嗜热需氧芽孢杆菌仅有样品5和样品21有检出，检出率较低，仅6.7%。从检出数量来看，需氧芽孢杆菌均未超过103CFU/mL，嗜热需氧芽孢杆菌大部分＜10 CFU/mL；从检出种类来看，3 个牧场需氧芽孢杆菌检出次数排在前3 位的是枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和短小芽孢杆菌；从不同牧场来看，芽孢杆菌检出率最高的是牧场C，其次为牧场A，检出率最低的是牧场B，检出芽孢杆菌种类最多的是牧场C，其次是牧场B，最少的是牧场A。

表3 不同牧场生牛乳芽孢杆菌检出数量及种类Table 3 Quantity and species of Bacillus identified in raw milk from different pastures

2.4 嗜热需氧芽孢杆菌耐热性实验结果

由表4可知，3 株嗜热需氧芽孢杆菌在6 种不同的热处理后，芽孢存活率有一定的差异。不同菌株在经过3 d增菌后，芽孢菌数均达到105CFU/mL。80 ℃/10 min处理后，杀死了营养细胞，剩余存活的均为芽孢，芽孢存活率为100%，由此可以推测，芽孢杆菌含量较高的生牛乳经巴氏杀菌后会残留芽孢，从而影响牛乳货架期。逐渐提高杀菌温度后，芽孢存活率明显下降，杀菌效率显著提升。经过115 ℃/20 min处理后，芽孢存活率均小于1%，大部分芽孢被杀灭，仅凝结芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌还有芽孢残留。直到121 ℃/20 min处理后，芽孢被全部杀死，杀菌效率接近4 个数量级。

表4 嗜热需氧芽孢杆菌耐热性实验结果Table 4 Heat tolerance of thermophilic aerobic Bacillus

3 讨 论

绝大多数需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌在普通的巴氏杀菌条件下不能被杀灭，而且生乳中耐热芽孢数越多，成品中的芽孢残留量也就越多，产品越容易变质[25-26]。高辉等[27]对石家庄市89 份乳品安全指标检测结果进行分析表明，生牛乳的需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌阳性率分别为83.33%、16.67%。想要控制生乳中耐热芽孢，首先要对生乳中芽孢杆菌进行分离，进一步了解这些芽孢杆菌的生物学特性，如耐热性、耐酸碱性、产酶特性等，本研究采集并选择含有芽孢菌的生牛乳样品开展研究，对生牛乳中耐热芽孢杆菌进行分离，通过形态学、生理生化和分子生物学3 种方法进行鉴定，共分离出10 株芽孢杆菌，其中3 株为嗜热需氧芽孢杆菌，分别为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌；另外7 株为需氧芽孢杆菌，分别为蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、明胶芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和环状芽孢杆菌，分离出的需氧芽孢杆菌较嗜热需氧芽孢杆菌多，其中在分离需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌时均分离到地衣芽孢杆菌，这些菌株多数为来源于土壤的微生物，经饲草或挤奶等环节进入生乳，而且据资料报道[28-29]，乳中最易污染的芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及环状芽孢杆菌等，在污染生牛乳的芽孢杆菌中，检出率最高的是枯草芽孢杆菌，占30%，其余依次为蜡样芽孢杆菌19%、短小芽孢杆菌11%、环状芽孢杆菌8%、缓慢芽孢杆菌8%、栗褐芽孢杆菌3%。本研究分离到的菌株与文献报道乳中易污染菌株总体来说是一致的，也分离到了嗜热的凝结芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和嗜中温的明胶芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，与文献报道有一定差异，可能是奶牛养殖环境差异等原因造成。

从生牛乳中分离到的10 株芽孢杆菌中，选取嗜热需氧芽孢杆菌进行耐热性实验，发现3 株嗜热需氧芽孢杆菌在不同的热处理条件下，芽孢存活率呈现随温度升高而逐渐递减的趋势，其中凝结芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌较地衣芽孢杆菌耐热性更强，经115 ℃/20 min处理后，仍有少量存活，而地衣芽孢杆菌已经被全部杀灭。经121 ℃/20 min处理后，所有芽孢均被杀灭，芽孢数量从初始的104CFU/mL下降到0，由此可以发现，芽孢杆菌对于湿热灭菌具有较强的耐受性，乳品生产企业需要特别关注生乳中嗜热需氧芽孢杆菌的污染情况，并关注可能造成污染的环节[30-31]，如饲草质量、奶牛饲喂环境、挤奶环节卫生清洁状况、生乳保存条件等，这些环节均会引入芽孢杆菌，严重影响生乳质量。国家也应当尽快推动乳品中需氧芽孢杆菌和嗜热需氧芽孢杆菌相关限量标准的设立，以进一步保证食品安全。

4 结 论

本研究以生牛乳为研究对象，分析30 份生牛乳样品中的芽孢杆菌种类，发现其优势菌为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、明胶芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌；耐热性实验表明，生牛乳中耐热性较强的芽孢杆菌有凝结芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌，最高能耐受115 ℃/15 min热处理。本研究结果可为生牛乳中芽孢杆菌的控制以及减少因芽孢杆菌引起的乳制品质量问题提供重要的参考依据。