亚硝酸盐氧化菌(NOB)的富集培养与其污泥特性分析

董怡君,王淑莹,汪传新,张宇坤,彭永臻 (北京工业大学,北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室,北京市污水脱氮除磷处理与过程控制工程技术研究中心,北京 100124)

短程硝化即实现AOB的富集以及NOB的抑制和淘洗,为当前脱氮领域研究的热点[1-3].通过调控温度、pH值、DO、FA、FNA、HRT等影响因素,可实现短程[4-7].因此,有必要对AOB和NOB分别富集培养以深入了解其种群性质以及动力学参数.于莉芳等[8]用富含高氨氮的污泥水富集AOB和NOB,FISH分析结果显示AOB占全菌总数的15.7%±3.7%,NOB占全菌总数的12.9%±3.2%;Chen等[9]用Membrane-Coupled Bioreactors(MBRs)工艺富集硝化细菌,FISH分析结果显示Nitrosomonas(AOB的一个种,菌体呈杆状或椭球状)占全菌总数的60%,不含Nitrobacter; Vadivelu等[10-13]用SBR富集NOB,FISH分析结果显示Nitrobacter占全菌总数73%.上述文献中多侧重研究全程硝化(AOB与NOB同时富集),或研究短程硝化(富集 AOB),由于其 NOB富集程度不高,不利于对 NOB动力学参数的研究.本验侧重富集NOB,并研究其特性,为准确测定NOB动力学参数打好基础.

1 材料与方法

1.1 试验装置及运行方式

采用小试 SBR来富集 NOB,反应器容积为12L,其有效容积为 8L,反应器密封.装置每天运行4个周期,每个周期时间为6h,其中进水10min,曝气并搅拌5h,沉淀40min,排水10min.每次进水2L,水力停留时间为20h,温度控制在(25±1); ℃曝气量恒定为 0.12m3/h,溶解氧变化范围为 5.4～8.4mg/L;搅拌转速为 185r/min; pH 值在 7.2～7.7之间.

1.2 试验用水及接种污泥

采用配水富集 NOB,原水为去离子水,以减少其他细菌或杂物进入系统.以NaNO2作为唯一的能源,其进水浓度范围为 150～1000mg/L.每升配水中,其他成分如下[10]:0.4g NaHCO3,1g KH2PO4,1.31g K2HPO4以及2mL的微量元素溶液.每升水中微量元素成分为[11]:1.25g EDTA,0.55g ZnSO4·7H2O,0.4g CoCl2·6H2O,1.275g MnCl2·4H2O,0.4g CuSO4·4H2O,0.05g Na2MoO4·2H2O,1.375g CaCl2·2H2O,1.25g FeCl3·6H2O,44.4g MgSO4·7H2O.接种污泥取自处理某大学居民区生活污水的中试 SBR,其污泥具有正常的硝化功能.

1.3 试验方案

试验共运行 65d,根据不同的运行状况可分为 2个阶段:第 1阶段(0～38d),为提升负荷阶段,进水亚硝酸盐氮浓度为 150～800mg/L,在反应周期末系统中的亚硝酸盐氮浓度小于0.2mg/L时提升进水浓度,即提升负荷,提高NOB的富集程度;第 2阶段(39～65d),为稳定运行阶段,进水亚硝酸盐氮浓度为800～1000mg/L.

1.4 检测指标及分析方法

温度、pH值和ρ(DO)采用德国WTW Multi 340i及相应传感器在线检测. ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(MLSS)、ρ(MLVSS)等指标均采用国家规定的标准方法测定[14];污泥的沉降速度、含水率、平均粒径等指标根据Beun等[15]的方法测定;采用Olympus-BX61型显微镜,对污泥形态及微生物相进行观测,并通过 FISH技术对NOB进行定性及半定量分析;经预处理后,采用FEIQuanta 200型扫描电镜观察污泥的微观结构.

表1 试验过程中FISH分析所用的探针序列、杂交缓冲液浓度及目标菌Table 1 FISH probes used, their target groups and hybridization conditions in this study

按照Amann等[16]的操作方法进行FISH分析.采用4%PFA,4℃条件下对污泥样品固定2～3h.对固定后的污泥样品超声分散1min,将样品滴加在明胶包被过的载玻片上,空气中干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脱水3min.杂交缓冲液组成包括0.9mol/L NaCl、20mmol/L Tris/HCl,0.01% SDS和甲酰胺,pH值为7.2.将荧光标记的寡核苷酸探针溶解于杂交缓冲液中,在46℃下与污泥样品杂交 2h.杂交结束后,采用洗脱缓冲液在48 ℃下洗脱20min.在干燥后的样品上滴加抗荧光衰减液,对每个污泥样品随机拍摄20～25张照片(OlympusBX61荧光显微镜)用于定量分析.FISH分析所使用的探针序列、缓冲液浓度及目标菌见表1.

2 结果与讨论

2.1 各阶段进出水水质变化

由图 1可以看出,亚硝酸盐氮出水浓度初始时为32mg/L,在第4d降低到0.2mg/L以下并逐渐平稳,相应的其去除率也由 53.6%升高并逐渐趋近于 100%,直至富集 65d,亚硝酸盐氮出水浓度一直在 0.2mg/L以下,相应的去除率也一直接近于100%.

图1 富集过程中混合后NO2--N浓度、出水NO2--N浓度及其去除率变化情况Fig.1 Variations of initially mixed NO2--N concentration,effluent NO2--N concentration and removal rate of NO2--N during the experimental period

图2 原水NO2--N浓度及比硝化速率变化情况Fig.2 Variations of NO2--N concentration of raw wastewater and specific nitrification rate

如图 2所示,原水亚硝酸盐氮的浓度由150mg/L逐渐增加至1000mg/L.在富集过程中,污泥中的NOB经过4d的培养逐渐适应了生长环境的变化,反应时间内可以完全氧化所添加的亚硝酸盐,因此提高负荷.进水亚硝酸盐氮的浓度由150mg/L逐渐增加至800mg/L时,NOB的富集程度逐渐升高,因此其比硝化速率持续增加,最大值为 131.03mg/(g MLVSS·h);而由 800mg/L 增加到1000mg/L时,比硝化速率开始降低.在稳定运行20d后,比硝化速率开始增加并恢复.这是因为,原水亚硝酸盐氮浓度为 1000mg/L时,进水混合后FNA浓度为0.0364mg HNO2-N/L,此浓度的FNA抑制了亚硝酸盐的氧化,可能也会抑制 NOB的生长;而当维持进水亚硝酸盐氮浓度为1000mg/L一段时间后,比硝化速率又有恢复,说明NOB可以适应此浓度的FNA.

图3 第40d第2周期的NOx浓度、pH值及DO的变化情况Fig.3 Variations of NOx concentration, pH and DO at the second cycle of 40th day

污染物浓度每小时取样1次,pH值及DO间隔5min读数1次(图3).为方便分析,将亚硝酸盐降解完成的点称为亚硝酸盐拐点(NBP).在此周期内,亚硝酸盐氮浓度值与时间的线性关系方程为 Y=-1.131X+199.2(R2=0.999),可看出亚硝酸盐降解曲线线性程度很高,说明此反应为零级反应,亚硝酸盐降解过程中一直以最大速率 umax进行.由图3可以看出,pH值在整个反应周期内基本没有变化,维持在 7.5左右,这是由于在反应体系中有HCO3-存在,对pH的变化有缓冲作用,因此,反应过程中的 pH值基本不变.亚硝酸盐氧化过程中,DO基本保持平衡,这是由于亚硝酸盐氧化速率的小幅度变化导致耗氧速率变化程度较小,而供氧速率不变,因而会引起DO小幅度的变化;而当出现 NBP点时,DO会有大幅度的上升,直至DO达到最大值后保持不变.

2.2 富集前后的菌群结构变化情况

经过 65d的富集培养,污泥浓度约为700mg/L.FISH 分析结果显示(图 4),接种污泥中Nitrospira占全菌总数的0.01%,Nitrobacter约占全菌总数的0.01%;而在培养65d后, Nitrospira约占全菌总数的5%,Nitrobacter约占全菌总数的80%.由此可见,NOB菌在活性污泥中占绝对优势.

图4 接种污泥及培养65d后系统中活性污泥FISH分析Fig.4 The FISH analysis of inoculum and activated sludge after 65d for the cultivation

图5 接种污泥和富集成功后污泥的光学显微镜照片Fig.5 Phase contrast microscopy picture of inoculums and sludge after enrichment

本试验富集NOB的优势菌种为Nitrobacter,主要原因可能是进水亚硝酸盐氮浓度(1000mg/L)比较高,FNA浓度(0.0364mg HNO2-N/L)比较高,反应过程 DO 浓度(5.4～8.4mg/L)较高,这样的条件较适合Nitrobacter的生长.而Vadivelu等[12]采用缓慢进水的方式,控制较高 DO 浓度(2.75～3.25mg/L),持续进水270min,运行12个月也富集出 Nitrobacter占全菌总数 73%的活性污泥;Blackburne等[17]采用每 2h一次的脉冲式进水,控制混合后亚硝酸盐氮浓度小于 100mg/L,成功富集出以Nitrospira为优势菌种的活性污泥.

2.3 富集前后的污泥性质变化情况及成因分析

富集前后污泥形态特征存在差异.由图 5所示,接种污泥结构比较松散,形态不规则;富集后污泥形成大小不同的椭圆形污泥,排列整齐,形态规则.由图 6所示,富集成功后的污泥呈椭圆形,表面光滑,边界清晰.由表1可看出,富集前后污泥含水率由99.5%降低到72.5%,MLVSS/MLSS由0.879降到了0.278,SVI降低到了6mL/g左右.上述数据表明,SBR系统中的污泥已由絮体污泥转化为颗粒污泥.污泥含水率较低,可简化污泥后处理工序.富集后污泥比耗氧速率为 169.3高于接种污泥,这是因为NOB的富集程度比较高.

图6 富集成功后污泥的扫描电镜照片Fig.6 Scanning electron microscopy picture of sludge after enrichment

“晶核假说”原理认为,颗粒污泥的形成类似于结晶过程,在晶核的基础上,颗粒污泥不断发育,最终形成了成熟的颗粒污泥;而晶核一般来源于接种污泥或反应器运行过程中产生的无机盐沉淀或惰性有机物[18].由表 2得知,富集前后污泥MLVSS/MLSS降到 0.278,且 SVI为 6,这说明污泥无机质含量很高,而在测污泥浓度时已用不少于250mL的去离子水洗泥,说明污泥中所含的无机质均为沉淀物.富集试验用水中含有 Ca2+、Mg2+、Fe3+等金属离子以及 HCO3-、HPO42-、等阴离子,且 pH 值维持在 7.2～7.7之间,此时,金属离子易与CO32-、HPO42-等阴离子形成沉淀物[19-20].根据“晶核假说”,这些沉淀物可作为晶核,在其基础上形成颗粒污泥.因此,本试验形成颗粒污泥的主要原因是絮体污泥以无机沉淀物为晶核形成颗粒污泥,而试验采取较长的沉淀时间以及不排泥的运行方式促进了该过程的进行.本试验这种运行方式与传统培养颗粒污泥的方式(逐渐缩短沉淀时间,促进 EPS形成等)并不相同,这种方式更有利于将形成的晶核尽可能多的保留在系统中,比较适用于培养长污泥龄的颗粒污泥.

表2 接种污泥和富集后污泥的特性Table 2 Characteristics of inoculum and sludge after enrichment

3 结论

3.1 在 SBR中采用恒定曝气量的方式,以亚硝酸盐为唯一能源,逐步提高进水亚硝酸盐浓度可实现 NOB的快速富集.经过 65d的富集培养,NOB成为优势菌种,经 FISH分析显示Nitrobacter占全菌总数的80%.

3.2 富集过程中发现,当混合液 FNA浓度达到0.0364mg HNO2--N/L时可能会对亚硝酸盐氧化过程有抑制作用,而经过一段时间的适应,硝化能力能够恢复.

3.3 富集成功后,SBR中的污泥已由絮状污泥转变形成颗粒污泥.与富集前污泥相比,SVI有明显的降低.本试验较长的沉淀时间以及不排泥的运行方式是该硝化颗粒污泥形成的重要原因.

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