镉胁迫对菜豆幼苗基因组DNA多态性的影响

吕金印,邸丽俊,叶庆富 (1.西北农林科技大学生命科学学院,陕西 杨凌 712100；2.陕西理工学院科技处,陕西 汉中 72000；.浙江大学原子核农业科学研究所,浙江 杭州 10029)

镉是生物毒性显著的重金属元素之一[1],在植物体内积累到一定程度时就会引起植株根系发育不良[2]、光合速率下降[3],细胞内的活性氧代谢失衡,叶片中丙二醛含量随镉浓度升高而逐渐升高[4],从而影响蛋白质的合成、运输及降解代谢过程[5].还原型谷胱甘肽和脯氨酸含量是典型的逆境生理指标,在受到镉污染时植物体内还原型谷胱甘肽和脯氨酸含量增加,以应对重金属的毒害效应.基因组DNA作为遗传信息的载体,最大的特点之一就是稳定性,然而镉污染会对细胞DNA造成损伤,由此影响遗传信息的传递.镉进入细胞后能引起部分细胞周期的永久阻滞、凋亡,与 DNA损伤修复有关[6-8],并直接或间接造成遗传毒性[9],影响基因表达调控与细胞信号转导途径[10].

随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析技术早期被用于检测害虫[11]、病毒、大肠杆菌[12-13]及大型藻类[14]中低剂量化学污染物造成的 DNA构象改变所引起的遗传不稳定性.目前,该技术已广泛用于东南景天属植物的品种分类[15]、遗传作图[16]、土壤酶活性、微生物群落结构[17],以及水生生态系统中镉污染对斑马鱼等生物体内 DNA损伤的检测[18].有关重金属污染对植物[19]、尤其是蔬菜作物[20]基因组DNA多态性的影响研究鲜见报道.本研究以菜豆幼苗为试材,结合多种生理指标,测定不同浓度镉胁迫下地豆幼苗叶片DNA多态性的变化,构建RAPD评价体系,探讨镉胁迫对植物生长发育的影响,旨在为农业生产中镉污染的预警与评价、蔬菜无害化栽培提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料培养

供试菜豆品种为地豆王2号(购自西安市华星种子公司).挑选籽粒饱满种子,用 1%H2O2溶液灭菌 10min,经无菌水反复冲洗后,置于培养皿,恒温培养箱催芽,温度为:25℃;相对湿度: 70%～75%,待胚根长至 3cm长,移至长×宽×高: 20cm×10cm×8cm水培槽中,加Hoagland营养液,在光合培养室进行水培.温度:昼/夜(27±3)/ (21±3)℃;湿度:(65±5)%;光照:昼/夜 14/10h,光强:150μmol/(m2·s).待子叶伸展完全,挑选生长一致的幼苗移入镉处理水培槽中.植株长至三叶一心时,在同一生长期采用 CdCl2·2.5H2O处理,镉处理浓度为0,20,40,80mg/L,每盆5株.每个处理10盆重复.处理7d后采样,采集的菜豆幼苗样品用蒸馏水冲洗,吸水纸吸干表面水分.一部分鲜样用于测定生理指标;一部分样品放入烘箱烘干,用于测定生物量及镉含量;另一部分用液氮冷冻处理后冷冻(-20℃)保存,用于分析 DNA损伤状况.

1.2 生物量测定

分别采各处理菜豆植株5株,用自来水反复冲洗,吸水纸吸干表面水分,105℃下杀青 15min, 80℃烘干至恒重,称根、茎、叶各器官干重.

1.3 镉含量测定

将 Cd2+处理菜豆幼苗植株分为根、茎、叶三部分,分别用自来水及去离子水冲洗,吸干水分,105℃杀青 15min,80℃烘干至恒重,磨碎混匀,加入HNO3-HClO4(4:1,V/V)混合酸,220℃沙浴消化,利用火焰原子吸收分光光度计(Z-5000赛曼,日立公司)测定Cd含量[21].

1.4 生理指标测定

丙二醛(MDA)含量测定采用TBA比色法[22];可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝 G-250法[23];脯氨酸(Pro)含量测定采用酸性茚三酮显色法[22];还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定采用DTNB显色法[23].

1.5 菜豆幼苗叶片基因组 DNA 的提取与RAPD图谱检测

DNA的提取:称0.2g菜豆叶片,加液氮充分磨碎,采用CTAB方法提取基因组总DNA.然后,加RNAase对DNA粗提液37℃下消化60min,以去除其中 RNA污染.弃消化后的上清液,沉淀用75%乙醇清洗2次,溶于灭菌双纯水中,进行下一步实验.所得的 DNA以紫外分光光度法分别检测A260和A280,计算A260/A280,如比值介于1.8～2.0之间则认为DNA纯度良好.

RAP-PCR扩增及检测:8条随机引物、TaqDNA聚合酶及dNTPs均购于大连宝生物工程技术有限公司.引物编号及碱基序列如下[24-27], P1:d5’(GTGACGTAGG)3’; P2:d5’(CCGAATTCCC)3’;P3:d5’(GGCTGCAGAA)3’;P4:d5’(GGTGCGGGAA)3’; P5: d5’(GCGGTTTTGC)3’; P6:d5’(GGCACTGAGG)3’; P7: d5’(CACTCTCCTC)3’; P8:d5’(CACTCTCCTC)3’.

PCR扩增反应体系的总体积为25μL,其中包括cDNA模板2μL,10×Buffer 2μL,MgCl2(25mmol/L) 2μL, dNTPs (2mmol/L) 2μL,引物(10μmol/L) 2μL, TaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL,加 ddH2O 到25μL;扩增反应程序为 94℃预变性 5min后, 94℃变性30s,40℃退火30s,72℃延伸90s,40循环;72℃延伸 7min.采用 1%琼脂糖凝胶(加入EB使其终浓度为 0.5μg/mL)电泳检测 PCR扩增产物.

1.6 数据处理

耐性指数(TI)=镉处理菜豆生物量/对照生物量×100%[28].

根系镉滞留率(RR)=(地下部分镉含量-地上部分镉含量)/地下部分镉含量×100%[22].

基因组模板稳定性(GTS)用下式计算:GTS= (1-a/n)×100%,式中,a为处理组菜豆幼苗叶片的RAPD多态性谱带数,即与对照组相比,处理组新出现的和消失的PCR谱带之和,n为对照组的总谱带数[14].

试验数据用 SPSS16.0软件进行方差分析(ANOVA)和LSD检验,数值结果表示用3次重复的平均值±标准差.

2 结果与分析

2.1 不同浓度镉处理对菜豆幼苗生物量的影响

生物量是衡量植株生长对重金属耐性的重要指标.本试验中随着 Cd处理浓度的增加,菜豆幼苗根、茎、叶生物量均呈下降趋势,中、高浓度Cd处理(40,80mg/L)下叶、根生物量与对照相比差异显著(P＜0.05)(图1A),尤其高浓度Cd处理下根生物量下降了 15.3%.而低浓度镉(20mg/L)处理下菜豆植株生物量与对照差异不大.耐性指数是指植株对镉的忍耐程度.本试验中随着 Cd处理浓度的升高,耐性指数呈下降趋势,与生物量变化一致(图1B).

2.2 不同浓度镉处理对菜豆幼苗镉含量的影响

本试验中随着Cd处理浓度增加,菜豆幼苗植株不同器官中镉含量上升(图 2A),尤其在根中增幅较大.与对照相比,20,40,80mg/LCd处理下根中分别增加了9.6、40.8和64.5倍.菜豆不同器官对镉的吸收累积能力为:根＞叶＞茎.不同浓度镉处理根系对镉的滞留率明显高于对照(图 2B).可能是降低镉向地上部位的迁移力,以减轻过量镉对其他器官的毒害作用,提高植物的忍耐能力.

图1 不同浓度Cd2+处理对菜豆幼苗生物量及其耐性指数的影响Fig.1 Effect of different Cd2+ concentration on the biomass and tolerance index in Phaseolus vulgaris seedling

2.3 不同浓度镉处理对菜豆幼苗生理特性的影响

丙二醛(MDA)通常作为植物对逆境反应及细胞膜脂过氧化程度的重要指标.本试验中,随着Cd处理浓度的增加,菜豆叶片MDA含量升高(图3A),3种Cd浓度(20,40,80mg/L)处理下分别比对照增加了0.3,1.8和0.99倍.

可溶性蛋白和脯氨酸(Pro)是植物体内主要的渗透调节物质.一般认为,重金属胁迫影响植物体内蛋白质代谢.本试验中,低浓度 Cd (20mg/L)处理下可溶性蛋白含量升高,中、高浓度 Cd(40,80mg/L)处理下蛋白含量下降(图3B).可能是在低浓度镉胁迫下诱导产生一些逆境蛋白,高浓度镉处理下植株体内蛋白质合成受阻,分解加快.

图2 不同浓度Cd2+ 处理对菜豆幼苗镉含量及滞留率的影响Fig.2 Effect of different Cd2+ concentration on the content of Cd and the retention rate in Phaseolus vulgaris seedling

非酶物质还原型谷胱甘肽(GSH)是植物细胞中重要的抗氧化剂之一.GSH可以通过调节膜蛋白巯基与二硫键化合物的比例,对细胞膜起保护作用.本试验中,低、中浓度 Cd(20, 40mg/L)处理下 GSH、Pro含量升高,高浓度Cd(80mg/L)处理下则下降,且降幅显著(P＜0.05)(图3C、3D).

2.4 不同浓度镉处理下菜豆幼苗 DNA纯度电泳检测

泳道a、b、c、d分别代表0,20,40,80mg/L镉处理;M:代表分子大小标准参照物.

图3 不同浓度Cd2+ 处理对菜豆幼苗生理特性的影响Fig.3 Effect of different Cd2+ concentration on physiological characteristics in Phaseolus vulgaris seedling

DNA作为生物体主要遗传物质,具有相对稳定性.对不同镉胁迫处理的菜豆叶片同条件同批次提取DNA,进行电泳检测(图4),对照组条带亮度清晰锐利,没有拖尾,表明提取的DNA完整性良好,没有降解.20,40mg/L镉处理下,DNA样品也保持了较好的完整性.但在 80mg/L镉浓度处理下,DNA条带出现大幅弥散和拖尾,表明高浓度镉胁迫影响菜豆植株体内的遗传物质合成和储存,引起 DNA大量降解.

图4 不同浓度Cd2+处理下菜豆幼苗DNA电泳检测Fig.4 Electrophoretogram of genomic DNA extracted by CTAB in leaves of Phaseolus vulgaris seedling under different Cd2+ concentration

2.5 基因组DNA多态性(RAPD)分析

为进一步分析镉胁迫对DNA层面的损伤,本试验对同批次提取的DNA进行遗传标记多态性分析,选用8条随机引物P1～P8,以叶片提取的DNA为模板进行PCR反应,图5和表1显示8条随机引物都获得了良好稳定的多态性谱带.镉处理下DNA多态性谱带与正常植株相比存在明显差异.与正常植株相比,20,40mg/L Cd处理后多态性谱带已经发生明显偏移(如图5所示,“＋”代表新出现的条带,“－”代表消失的条带,“I”代表带强增强的条带,“D”代表带强减弱的条带),引物 P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8的多态性谱带中的部分条带出现缺失,引物P1、P4、P6、P7的多态性谱带中还出现了新的条带,此外P3、P4、P5、P6、P7、P8的某些条带还出现增加或强弱的现象,说明中低浓度的Cd处理就已经对基因组DNA造成了一定的损伤.当Cd浓度提高至80mg/L后,8条引物中几乎所有的谱带都消失了,说明此时的DNA模板已经受到了非常严重的损伤.以表1数据为基准,根据公式计算基因组模板的稳定性(图6).20,40mg/L Cd处理后,基因组已经出现不稳定,稳定性仅为69.6%和60.9%,80mg/L处理后基因组出现大面积崩溃,稳定性降为2.1%.

图5 不同浓度镉处理下菜豆幼苗叶片RAPD图谱Fig.5 RAPD profiles of DNA from leaves of Phaseolus vulgaris seedling under different Cd2+ concentration

图6 菜豆幼苗叶片基因组模板稳定性(%)Fig.6 The Stability of genome template of Phaseolus vulgaris seedling (%)

表1 镉处理下菜豆幼苗叶片基因组多态性变化Table 1 Changes of total bands in control, polymorphic bands and varied bands in Cd-contaminated in leaves of phaseolus vulgaris seedlings

3 讨论

镉是植物非必需元素,其毒害效应已受到人们的广泛关注[6].镉污染会对农作物生理生化上造成不同程度的影响.

一般认为,植物在逆境下受伤害越严重, MDA含量越高[29].本试验中,MDA含量随着镉处理浓度的上升而增加,说明镉胁迫已对膜系统造成损伤.还原型谷胱甘肽(GSH)对镉胁迫的解毒起关键作用.高等植物产生的植物螯合肽(PC)是镉解毒的广泛机制[30],而还原型谷胱甘肽(GSH)是 PC的合成前体,同时也可以与金属离子直接络合,其水平决定植物自身解毒能力的强弱.本试验中,在低、中浓度镉处理(20,40mg/L)下菜豆幼苗体内GSH含量升高,高浓度Cd2+(80mg/L)处理下 GSH含量下降,且降幅显著.Liu等[19]认为,随镉含量升高,大麦幼苗根系生长及可溶性蛋白总量均受到抑制.本试验表明,低浓度镉处理下,可溶性蛋白及Pro含量略增,中、高浓度则下降.可溶性蛋白和 Pro的变化趋势与我们在芹菜中的研究结果一致[22].

基因组 DNA是遗传信息的载体,具有遗传稳定性,但是镉污染会造成DNA损伤,从而干扰遗传信息的顺利传递.镉等重金属进入生物体内,干扰生殖过程中的细胞周期[7],如DNA复制、有丝分裂、原生质体的子细胞分裂和形成等,且与镉离子呈剂量-依赖关系[9].在早期的研究中,Williams等分别采用象鼻虫[11]、拟南芥[31]、大嘴鲈鱼[32]建立RAPD模型,用以分析DNA损伤,即RAPD图谱表现为谱带强度增或减,谱带的消失或新增.本试验与 Liu等[19]对镉处理大麦幼苗 DNA损伤结果相类似.在低、中浓度镉处理下,DNA样品保持了较好的完整性.但在高浓度镉(80mg/L)处理下,DNA条带出现弥散和拖尾,可能是由于高浓度镉造成基因组DNA的大面积断裂和崩溃,形成许多弥散小片段DNA.

RAPD图谱的变化趋势可以定性的衡量基因组模板DNA的稳定性[33].本研究表明,低浓度镉(20mg/L)胁迫已对菜豆基因组DNA造成损伤,多态性谱带中出现了条带增加和缺失现象,基因组稳定性降至69.6%;当镉浓度提高至80mg/L时,基因组 DNA造成了大面积损伤,多态性谱带几乎全部消失,基因组稳定性降至2.1%.

综合生理和生化指标,本研究中低浓度镉(20mg/L)胁迫就会造成菜豆幼苗的损伤,但因植物体内本身也存在对重金属毒性的抵抗和修复作用机制,此时植株可以维持正常的生理代谢过程,外在生理生长特性暂时没有明显的可见变化,但通过RAPD技术在基因组层面上则可以观察到明显的损伤,这种对遗传物质的直接损伤将影响正常的遗传代谢.高浓度的镉(80mg/L)胁迫则会导致植物体内生理代谢系统的紊乱和遗传系统的崩溃,从而导致植株死亡.有关镉对菜豆幼苗DNA的损伤机制还有待进一步研究.

4 结论

4.1 随着镉处理浓度的增加,菜豆幼苗生物量、还原型谷胱甘肽、脯氨酸及可溶性蛋白含量下降植株各器官中的镉含量增加.

4.2 8条引物均产生了独特的多态性条带.对照组叶片基因组DNA的RAPD图谱获得46条谱带.

4.3 与对照相比,镉浓度处理下的 RAPD图谱发生了改变,呈现谱带强度增强或减弱、谱带消失或新增.20,40mg/L镉处理下出现新条带分别为2和4条.随镉处理浓度增加,消失的条带增多,尤其80mg/L处理下消失条带达44条,可能与镉处理引起的DNA构象改变及多种损伤有关.

4.4 RAPD分析技术可作为蔬菜等相关作物早期重金属污染伤害的有效评价指标,可为轻度镉污染区菜豆等蔬菜品种选育、镉污染毒性评价提供依据.

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