剩余污泥超声提取液培养生物破乳菌 Alcaligenes sp. SXJ-1

黄翔峰,朱其玮,申昌明,王 珅,陆丽君,刘 佳(同济大学环境科学与工程学院,污染控制与资源化国家重点实验室,上海 200092)

剩余污泥超声提取液培养生物破乳菌 Alcaligenes sp. SXJ-1

黄翔峰,朱其玮,申昌明,王 珅,陆丽君,刘 佳*(同济大学环境科学与工程学院,污染控制与资源化国家重点实验室,上海 200092)

将超声法预处理剩余污泥得到的提取液用于培养高效生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1,以探索剩余污泥资源化利用的新途径.使用超声能量(ES)为443～56647kJ/kg TS的超声条件处理剩余污泥,获得的污泥提取液中氨氮、有机氮、总磷的浓度最高分别为171.94,142.20, 76.29mg/L,提取液中包含K、Ca、Mg、Fe等破乳菌生长必须的金属元素.将污泥提取液(ES为885～56647kJ/kg TS)作为培养基用于合成高效破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1,产量较MMSM培养基可提高0.3%～68.3%,其中ES为56647kJ/kg TS时破乳菌产量最高,为2.03g/L.污泥提取液中的 pH缓冲能力对菌体产量有重要影响,提取液的有机氮浓度可能是破乳菌产量提高的关键因素.污泥提取液培养的破乳菌破乳性能稳定保持在80.0%左右,菌体细胞表面疏水性与菌体C/N较MMSM培养基培养菌体无明显差异.说明以剩余污泥超声提取液作为培养基可以培养稳定高效的破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1.

剩余污泥；资源化；超声法；生物破乳菌；培养基

活性污泥法是目前使用最为广泛的污水处理方法,具有处理效率高、处理成本低的优点.但该法在污水处理的同时产生大量的剩余污泥,其处理处置给人们带来了许多技术和经济投入上的问题及挑战[1-2].目前最常用的剩余污泥处置方法是填埋,占用了大量的空间资源[2-3],也浪费了污泥中蕴藏的大量物质能量资源.在污泥最终处置前采用适当的方法对其中的资源进行利用,一方面可以资源化利用这些物质,另一方面也有利于减少最终处置的成本和压力.近年来,国内外对剩余污泥的资源化途径研究主要包括制备建材[4]、吸附剂[5]以及厌氧产气[6-8]、热解制油[9]等,利用剩余污泥生产具有高附加值生物制品的研究也有所进展,如成功培养 PHAs合成菌[10]以及生物杀虫剂生产菌[11]等.

剩余污泥经过破解后才能释放其中的有机质及各类营养元素.超声法是一种常见的用于破解污泥的预处理方法,具有操作简单、处理效率高等优点[12-13].在对剩余污泥进行超声的过程中,超声波引起的“空穴现象”[14]能够达到破解污泥的效果.低频高声能密度的超声波能有效打碎污泥絮体并溶解其中的菌体细胞[15],令其中碳、氮、磷和其他各类营养元素进入液相,使剩余污泥具备了能够生产具有高附加值生物制品的潜力.

生物破乳剂是生物表面活性剂的一种,能够对乳状液进行破乳,实现油水的分离.与化学破乳剂相比,生物破乳剂具有高效、低毒性、易生物降解等特点,可广泛应用于原油乳状液破乳、含油废水处理、食品加工、生物制药等领域[16].前期研究中,从油田含油土壤中筛选得到一株破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1,在原油乳状液和模型乳状液中具有较好的破乳效果[17-18],但由于其生产成本较高,因此其大规模应用受到了限制.

开发廉价碳源是降低生物破乳剂成本的途径之一[19-20],本课题组前期曾研究尝试使用废弃油脂等废弃物替代培养基中的碳源以降低破乳菌生产成本[21].但使用废弃物取代生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1合成培养基的研究仍是空白.本研究以剩余污泥这种廉价原料超声后获得的污泥提取液取代无机盐培养基(MMSM)用于生物破乳菌的培养,研究 S-XJ-1在污泥提取液中的生长情况,以期为生物破乳剂低成本生产和剩余污泥资源化提供一种新的途径.

1 材料与方法

1.1 剩余污泥

本研究使用的剩余污泥来源于上海曲阳污水厂污泥浓缩池.取得污泥后,将其在 4℃条件下自由沉降 24h进行浓缩,得到用于超声处理的剩余污泥样品,其性质见表1.

1.2 超声处理及污泥提取液的制备

超声处理采用 BRANSON ultrasonic, Co, USA Model 250细胞破碎仪,1/2″探头,工作频率20kHz.运行模式为超声5s,停止5s.超声污泥体积350mL,设置0℃冰水浴环境.

表1 剩余污泥样品性质Table 1 Properties of excess sludge

本研究选取不同超声能量(ES, kJ/kg TS)对污泥样品分别进行预处理考察不同超声能量对污泥破解的影响.超声能量的定义见式(1):

式中:P为超声功率,W;t为作用时间,s;V为污泥体积,L;TS为污泥总固体浓度,g/L.

超声结束后,将所得的污泥混合液在12000r/min离心10min,随后经0.45μm滤膜过滤,即得到澄清的污泥提取液样品.

1.3 生物破乳菌的培养

本试验采用的菌种为一株由新疆克拉玛依油田受石油污染土壤中筛选得到的高效破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1.传统的培养方式采用的是无机盐培养基(MMSM),其组分为(g/L):NH4NO3, 4.0;K2HPO4,4.0;KH2PO4,6.0;MgSO4·7H2O,0.2; CaCl2·2H2O,1.0×10-3;FeSO4·7H2O,1.0×10-3;EDTA, 1.4×10-3.碳源为4%(V/V)液体石蜡.

本研究中使用污泥提取液替代MMSM培养基进行生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1的培养,培养过程为:将培养基的 pH值调至 7.0,以250mL三角烧瓶分装100mL培养基与4%液体石蜡(V/V),121℃高压蒸气灭菌 20min(1×105Pa),冷却至室温后,向其中接入10%(V/V)的种子培养液,在恒温摇床中于35℃,130r/min下培养7d.

1.4 分析方法

1.4.1 污泥破碎程度 污泥超声后的破解情况通过DDCOD(degree of disintegration)[15]来评价,其定义见式(2):

式中:CODultrasound为超声处理后上清液样品的COD,mg/L;CODoriginal为未经超声处理的污泥上清液的 COD,mg/L;CODNaOH为污泥样品与1mol/L NaOH以1:2体积比混合后,在20℃下使用磁力搅拌器匀速搅拌反应 24h后经离心过滤获得的上清液COD.

1.4.2 污泥提取液成分 污泥提取液中总有机碳采用总有机碳测定仪(TOC-VCP Analyzer, SHIMADZU, JAPAN)测定.氨氮、凯氏氮通过蒸馏法测定(K9840凯氏自动定氮仪,济南海能仪器有限公司),有机氮则通过凯氏氮减去氨氮获得.总磷使用钼锑抗分光光度法测定(UV-2100,尤尼柯上海仪器有限公司).污泥提取液中金属元素含量采用电感耦合等离子发射光谱法测定(ICP-AES 720ES, Agilent).

1.4.3 生物破乳菌产量 采用干重法表示,将培养 7d后的全培养液于 12000r/min,4℃下离心10min,将离心所得物于-50℃冷冻干燥24h(Scientz-10N,宁波新芝生物科技股份有限公司)后称重,产量以g/L计.

1.4.4 破乳性能 菌体破乳性能参照 Huang等

[17]的方法:将菌体干粉加蒸馏水配成浓度为10g/L的菌悬液用于破乳实验,采用的模型乳状液为W/O型,具体配制方法参照文献[22].破乳实验采用瓶试法[23].破乳率的具体计算公式如下:

1.4.5 菌体细胞表面疏水性 细胞表面疏水性采用微生物黏着碳烃化合物法(MATH)测定,测试方法同Huang等[17].

1.4.6 菌体C/N 菌体C/N采用有机元素分析仪Vario EL(Vario EL,Elementar Analyser system. GmbH, Hanau, Germany)在CHN模式下测定生物破乳菌菌体元素组成后计算所得.

2 结果与讨论

2.1 超声能量对污泥破解的影响

如图1所示,随着ES的升高,污泥的DDCOD逐渐上升,破解程度呈递增趋势.在能量达到56647kJ/kg TS时得到最大的破解程度,为54.93%.当ES在0～42485kJ/kg TS范围内,DDCOD会随超声能量的提高明显上升,污泥破碎程度与超声比能呈正相关,但之后使用更高的超声能量,污泥的破碎程度很难继续提高,表明此时污泥的破碎程度已经接近极限.该结果与Bougrier等[8]和Lehne等[24]获得的结果相近.在污泥破解的过程中,随着超声强度的提高,污泥中挥发性悬浮固体(VSS)占悬浮固体(SS)的百分比也逐渐下降,从未经超声时的 66.00%至56647kJ/kg TS时达到最小值34.47%,其与DDCOD呈现相反的趋势,且在能量大于42485kJ/kg TS之后放缓下降的速度.污泥 DDCOD上升的比例与VSS/SS下降均体现了污泥固体中有机物向液相中转化的过程,当污泥破碎程度接近极限时,原污泥固体中有大量的有机物释放到液相中.

图1 不同超声条件对污泥破解效果的影响Fig.1 Influence of ESon the disintegration degree of excess sludge

2.2 超声能量对污泥提取液氮、磷元素释放的影响

氮源、磷源的种类和含量是培养基中影响生物破乳菌合成的重要因素.由图 2可见,氨氮和有机氮的浓度随超声能量的提高而增大,分别从16.24, 0.33mg/L增长至171.94,142.20mg/L.总磷在未超声的污泥清液中浓度就较高,达到了 76.29mg/L,超声后在低能量条件下就以较快的速率释放,最高浓度可达256.30mg/L.在Es达到42485kJ/kg TS后,污泥提取液中氨氮、有机氮及总磷的增长速度均会放缓,与污泥的破碎情况一致.

图2 不同超声条件对污泥提取液中氮磷元素释放影响Fig.2 Influence of ESon the release of nitrogen and phosphorus in excess sludge

超声波对污泥中元素的释放作用可以分为两部分:超声波水力剪切力引起的细胞EPS的释放,以及因超声波产生的羟基自由基导致细胞破坏带来的胞内物质的释放[25].氮元素的释放主要来源于超声波对污泥中细胞的破碎作用[8].污泥中的有机氮主要为蛋白质和氨基酸[8],在超声能量较低时(小于 1000kJ/kg TS),污泥破碎率低,因而释放的有机氮浓度也较低,随着能量的提高,溶胞作用发生后,释放量也得到了较大的提高.剩余污泥中磷元素的释放也与超声波对细胞的破碎作用有重要关系.剩余污泥中的磷元素主要来源于聚磷菌贮藏在细胞内的聚磷酸盐,当细胞被破碎后,聚磷酸盐会从细胞质中扩散出来[26],进入液相.超声处理前剩余污泥上清液中的磷元素浓度就较高,可能是污泥在采样后一直处于厌氧状态,发生了释磷现象.

2.3 超声能量对污泥提取液金属元素释放的影响

培养基中的微量金属元素对破乳菌的合成也起到非常重要的作用,K、Ca、Mg、Fe均为MMSM培养基中所含Alcaligenes sp. S-XJ-1生长必须的金属元素.而超声处理后的污泥提取液中也还包含一定种类的金属元素.由图4可见,污泥提取液中富含K、Ca、Mg元素,Fe元素含量较少.在能量为0～7081kJ/kg TS时,K和Mg含量随超声能量有一定的升高,当超声能量大于7081kJ/kg TS后,其上升幅度减小,而超声能量对污泥提取液中Ca、Fe的浓度影响不大.除了这4种微量元素外,污泥提取液中还含有Al、Li、As等元素,但浓度较低,其中 Li、As浓度均低于0.10mg/L.而如Cr、Cd、Mn、Pb等其他有毒重金属元素,则未在污泥提取液中检出.

图3 不同超声条件对污泥提取液微量金属元素释放的影响Fig.3 Influence of ESon the release of metalic elements in excess sludge

由上述结果可知,污泥提取液包含了生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1生长所需的各类元素,且有毒重金属元素含量较低,具有作为破乳菌培养基的可行性.但与MMSM培养基相比,其中元素的种类、含量大小差异较大.本研究中,为了保证菌体的正常生长,在污泥提取液中投加 4%的液体石蜡作为碳源,以避碳源种类和数量对菌体合成产生的影响[27].在此基础上考察污泥提取液取代MMSM培养基中其他元素及生长环境进行破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1的可行性.

2.4 不同污泥提取液对生物破乳菌产量的影响

将 9种超声强度获得的污泥提取液作为培养基培养高效生物破乳菌 Alcaligenes sp. SXJ-1,试验结果如图4所示.破乳菌的产量与污泥提取液的超声能量呈正相关.可以发现,超声能量为443kJ/kg TS对应的污泥提取液培养菌体所得的产量为 1.164g/L,略低于 MMSM 培养基(1.207g/L).当超声能量大于885kJ/kg TS后,污泥提取液培养菌体产量大于 MMSM培养基,使用超声能量为885～56647kJ/kg TS的污泥提取液培养生物破乳菌,产量可提高 0.3%～68.3%.在比能为 56647kJ/kg TS时生物破乳菌最高产量为2.03g/L.说明污泥提取液中营养元素浓度越高,获得的菌体产量也越大.

图4 不同污泥提取液对培养生物破乳菌产量的影响Fig.4 Influence of sludge extract on biomass of the demulsifying strain

如图4所示,经7d培养后,污泥提取液的pH值相比培养初始值 pH=7.0有不同程度的下降,443kJ/kg TS对应的污泥提取液pH下降最多,为5.78,在此pH值下菌体的合成会受到严重的抑制[28]..随着超声能量的提升,培养基初始pH缓冲能力越好,污泥提取液pH下降值逐渐减小,培养所得菌体的产量也越大.培养基的pH缓冲能力对破乳菌的合成效果有重要影响[27].由前期研究成果[27]可知,S-XJ-1是一株在中性和碱性环境下生长良好的菌,但在酸性环境下产量会明显下降,培养基初始pH=6.0时获得的菌体产量仅为初始pH=7.0时的一半.在培养过程中,菌体对碳水化合物的代谢会引起培养基 pH的下降[2],从而对破乳菌的合成产生抑制.类似的,一株产表面活性剂菌B.subtilis MTCC 2423在pH=6.5与pH=7.0的条件下生长,生物量会相差近一倍,表面活性剂产量相差30%[29].而Peseudomonasaeruginosa MR01在pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的条件下生长,菌体产量差别显著,分别为 0.05,0.20,1.65,1.67,1.72mg/L[30].当比能大于42485kJ/kg TS后,污泥提取液的pH值能保持在 6.60以上,与 MMSM 培养基(pH= 6.68)差异很小,说明污泥提取液已经具有足够的pH缓冲能力.

分析污泥提取液能够提高生物破乳菌产量的原因,可能是由于污泥经超声处理后释放的营养元素更易被菌体利用,且污泥提取液中存在的氨基酸等物质对生物破乳菌的生长起到了促进作用.Maria等[3]在使用经过高温水解所得的污泥提取液培养生物杀虫剂产生菌 Bacillus thuringiensis菌的研究中发现,预处理后污泥中易被菌体利用的碳源、氮源和其他生长所需营养元素的含量均会有所上升,从而促使菌体产量提高.研究发现,污泥提取液中氨氮与有机氮的浓度与菌体产量有良好的线性关系(R2=0.995与R2=0.983).污泥提取液中存在的作为氮源的物质可能是提高菌体产量的关键,需进一步研究.

2.5 不同污泥提取液对生物破乳菌破乳性能的影响

将污泥提取液培养得到的生物破乳菌进行破乳试验,考察污泥提取液对合成的破乳菌破乳性能的影响,试验结果如图5所示.各污泥提取液培养破乳菌在 1000mg/L投加量下,对于模型乳状液24h的破乳率在78.3%～84.4%之间,其中脱油率在78.7%～90.2%,脱水率75.2%～83.0%.破乳性能最好的为超声能量为42485kJ/kg TS对应的污泥提取液培养的菌体,与 MMSM培养基培养的菌体对模型乳状液的 24h破乳率(92.5%)相差不大.说明污泥提取液合成的生物破乳菌破乳性能能够达到预期的要求.

生物破乳菌的破乳性能与菌体细胞表面疏水性以及菌体表面物质元素组成有密切相关.前期研究结果表明[31],菌体表面的疏水性与菌体的破乳能力呈正相关,而菌体表面蛋白含量的升高会导致菌体表面疏水性的增强.由图6可知,不同污泥提取液培养菌体的疏水性差异并不显著,在81.09%～90.94%之间,与MMSM培养基培养的菌体(88.49%)相近.测定不同污泥提取液培养的破乳菌菌体的C/N后发现,9种污泥提取液培养所得菌体的C/N在5～6之间,与MMSM培养基培养所得菌体(C/N=5.00)差异也不大.这表明,使用污泥提取液为培养基培养的生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1菌体表面性质与元素组成与 MMSM培养基培养的菌体相近,故其在破乳性能上也没有明显差异.

图5 不同污泥提取液培养生物破乳菌的破乳性能Fig.5 Influence of sludge extract on the demulsfication performance of the demulsifying strain

图6 不同污泥提取液培养破乳菌的疏水性与C/NFig.6 Influence of sludge extract on the CSH and C/N of the demulsifying strain

3 结论

3.1 超声能量为 443～56647kJ/kg TS获得的污泥提取液中氨氮、有机氮、总磷的浓度最高分别为171.94,142.20,76.29mg/L.

3.2 污泥提取液(ES为 885～56647kJ/kg TS)合成高效破乳菌 Alcaligenes sp. S-XJ-1,产量较MMSM培养基可提高 0.3%～68.3%,其中 ES为56647kJ/kg TS时破乳菌产量最高,为2.03g/L,同时菌体的破乳性能保持稳定.

3.3 污泥提取液中的氮、磷、金属元素及 pH缓冲能力能够替代MMSM培养基满足S-XJ-1生长的需求,污泥提取液的有机氮浓度可能是破乳菌产量提高的关键因素.

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Cultivation of demulsifying bacteria Alcaligenes sp. S-XJ-1 using ultrasonic pretreated excess sludge.

HUANG

Xiang-feng, ZHU Qi-wei, SHEN Chang-ming, WANG Kun, LU Li-jun, LIU Jia*(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：424～430

In order to find a new way of excess sludge utilization, sludge extract was used in the biosynthesis of demusifier by Alcaligenes sp. S-XJ-1. It was practical to cultivate highly efficient demulsifying strains in sludge extract. Sludge extract was obtained by the untrasound condition of 443～56647kJ/kg TS. In sludge culture medium, maximun concentration of ammonia nitrogen, organic nitrogen and phosphorus were 171.94,142.20 and 76.29mg/L. Sludge extract contained metallic elements such as K, Ca, Mg, Fe that were essential to the synthesis of S-XJ-1. After 7days cultivation, the biomass of S-XJ-1in sludge extract was 0.3%～68.3% higher than that in MMSM. Highest yield (2.03g/L) was obtained when specific energy was 56647KJ/kg TS. pH buffering capacity and concentration of organic nitrogen might have a great impact on the yield. The bio-demusifier produced with sludge extract had a quite stable demusifying ration of 80%, of which the CSH and C/N did not show much difference to that with MMSM.

excess sludge；utilization；ultrasounication；demulsifying strains；culture medium

X703

：A

：1000-6923(2014)02-0424-07

黄翔峰(1974-),男,福建古田人,教授,博士.主要从事生物破乳剂以及剩余污泥资源化相关研究.发表论文100余篇.

2013-06-14

国家自然科学基金项目(51108333);国家科技支撑计划(2012BAC11B00)

* 责任作者, 讲师, liujia@tongji.edu.cn