一株海洋细菌对中肋骨条藻的溶解效应及其溶藻特性

汪 辉,刘 玲,牛丹丹,刘兆普 (南京农业大学江苏省海洋生物学重点实验室,江苏 南京 210095)

一株海洋细菌对中肋骨条藻的溶解效应及其溶藻特性

汪 辉,刘 玲,牛丹丹,刘兆普*(南京农业大学江苏省海洋生物学重点实验室,江苏 南京 210095)

从山东胶州湾分离得到1株海洋溶藻菌,暂将其命名为JZ-1.根据生理生化及16S rDNA 序列分析鉴定,菌株JZ-1属于交替单胞菌属(Alteromonas).研究表明,菌株 JZ-1对中肋骨条藻具有很好的溶解效果,它能够破坏藻细胞膜内物质的结构和细胞膜的完整性,使细胞膜内物质流出导致藻细胞死亡.溶藻现象发生在细菌培养液的上清液和0.2µm的过滤液中,而不是在细菌菌体中,这表明菌株JZ-1通过分泌代谢物对中肋骨条藻产生溶解作用,且当菌株JZ-1由对数生长期向稳定期过渡时,其代谢物的溶藻率达到最大.代谢物分子量＜5kD,具有热稳定性、耐酸性,但不耐碱.

海水富营养化；中肋骨条藻；溶藻细菌；溶藻机理

海水富营养化程度加剧,海洋赤潮的暴发已成为世界各国所面临的重大生态灾害[1-2],对人类健康的威胁日益显著,对社会经济、海洋资源、生态环境以及人工水产养殖都造成极大的损害

[1-3].我国近岸海域赤潮发生的频率、波及范围和危害程度也呈上升趋势[4-5].中肋骨条藻作为一种在中国东部沿海广泛存在的广温广盐性的浮游硅藻,是易诱发赤潮产生的藻类之一[6].

与物理和化学控藻方法相比,生物控藻已成为防治赤潮和水华的一个新的研究方向[7-10],其中溶藻细菌被公认为是目前极具潜力的生物控藻新技术[11-12].溶藻细菌是指通过直接或间接方式,抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌[13-14].Doucette等[15]曾报道在水华和赤潮的发生、发展和消亡过程中,细菌以及细菌与藻类的相互作用是影响藻类生长的关键性的调控因素.

本实验室从胶州湾分离出一株溶中肋骨条藻有很好溶解作用的海洋细菌,暂时命名为 JZ-1.经过生理生化及16S rDNA 序列分析,鉴定出此菌株属于交替单胞菌属.本研究进一步探讨了该溶藻细菌对中肋骨条藻生理生态的影响和溶藻机理,并对细菌分泌的代谢物的性质进行研究,为更深入的研究溶藻细菌和探讨藻菌关系提供参考.

1 材料与方法

1.1 藻种来源及其培养

实验藻种为中肋骨条藻(Skeletonema costatum),由暨南大学水生生物研究所提供.藻种经活化后,采用f/2培养基[16],在温度为20℃,光照强度为50 µmol /(m2⋅s),光暗比为12h:12h的条件下 培 养 .培 养 基 成 分 为 :NaNO375mg, NaH2PO4·H2O 5mg,Na2EDTA 4.36mg,FeCl3·6H2O 3.15mg,CuSO4·5H2O 0.01mg,ZnSO4·7H2O 0.022mg, CoCl2·6H2O 0.01mg,MnCl2·4H2O 0.18mg, Na2MoO4·2H2O 0.006mg,硫胺素· HCl 0.1mg,生物素 0.5µg,维生素 B120.5µg.1L过滤海水.通过显微镜观察及血球计数板来观察中肋骨条藻细胞生长情况.

1.2 溶藻细菌的分离

从胶州湾的不同区域采集水样,将中肋骨条藻接到采集的水样中,通过血球计数板来观察中肋骨条藻的生长情况.将能够使藻液黄化的原水样按一定的梯度稀释,并接入MB琼脂固体平板中培养,多次重复直到得到单个菌落.将各个单菌落富集培养,并接种到试验藻中测试溶藻效果.MB琼脂培养基成分为:蛋白胨5g,酵母粉1g,琼脂15g.1L过滤海水.

1.3 细菌生理生化及分子生物学鉴定

细菌生理生化鉴定[17]:将细菌进行革兰氏和芽孢染色,于光学显微镜下观察染色结果;进行碳源和氮源利用试验.

16S rDNA序列分析:按Pitcher法提取细菌的基因组总DNA;以提取的DNA为模板,采用通用引物(正向 27F:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向1495R:5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)进行 16S rRNA基因扩增.反应条件:96℃预变性 5min;95℃变性 30s;52℃退火1min 30s;72℃延伸 1min 30s;30个循环,延伸10min.PCR 产物经检测纯化后.直接用 Taq DyeDeoxy Terminator cycle Sequencing Kit测序电泳及数据收集用 Applied T3iosystems DNA Sequences(model 377)自动进行.将所测的 16S rDNA序列经校对后.在GenBank数据库中进行BLAST比较.

1.4 液体溶藻试验

将菌株JZ-1的单菌落接种到MB培养基中,在20℃下振荡富集培养3d,使其密度达到107个/ mL.取10mL菌液加入100mL处于对数生长期的中肋骨条藻藻液中,设3个平行实验,每天观察藻液颜色变色,且每隔 2d定时取样,在光学显微镜下观察细胞损坏情况,并用血球计数板测量完整无损坏细胞的数量.

1.5 荧光显微镜下观察藻细胞变化

将菌株 JZ-1单菌落如上所述富集培养,取1mL菌液加入10mL处于对数生长期的中肋骨条藻藻液中,每 8h取样染色,采用氟硼荧作为荧光染色剂,在荧光显微镜下观察藻细胞形态.

1.6 溶藻机理的探讨

采用一次性培养方式将藻液培养至对数生长期,富集培养菌株 JZ-1,将细菌培养液与中肋骨条藻混合培养;另外,在8000r/min将细菌培养液离心 8min,分离上清液与菌体沉淀.取 10mL上清液加入100mL藻液中,进行溶藻试验;将菌体沉淀溶于 f/2培养基中,取其 10mL加入100mL藻液中,重复液体溶藻试验;另外,用0.2µm 滤膜过滤菌液,取10mL滤液加入100mL藻液中,重复液体溶藻试验.采用未进行任何处理的中肋骨条藻作为空白对照,进行液体溶藻试验.所有处理均重复 3次.定时取样,光学显微镜下计完整藻细胞数.

1.7 代谢物溶藻试验

将菌株 JZ-1单菌落接种至 MB培养基中,20℃下连续振荡富集培养 7d.自接种之日起,每天定时取 50mL细菌培养液用作代谢物提取.细菌培养液经8000r/min离心10min后收集上清液,加入2.5g离子交换树脂振荡混合过夜.用一小团棉球封住 20mL塑料针管的底部,将上清液与离子交换树脂的混合物注入针管中,液体随针孔流下,而树脂因为棉球的阻碍而留下棉球上方.然后用 20mL乙酸乙酯溶液洗脱代谢物,并于旋转蒸发仪中蒸发得到代谢物.

采用双层琼脂平板法进行固体培藻:取100mL对数生长期的中肋骨条藻经3000r/min离心 8min后,收集藻体.将藻体与 2.5mL微热的0.4%的 f/2软琼脂培养基混合,混匀后立即倒入事先准备好的浓度为 1.5%的 f/2硬琼脂培养基上铺平.

代谢物的溶藻效率采用滤纸片法[18]来测定:用少量的水溶解代谢物,用移液枪吸取 10µL代谢物至预先平铺在固体藻上的0.6mm的滤纸片上.将平板放于 20℃下过夜培养,根据抑藻圈的大小来计算代谢物的溶藻率.

1.8 代谢物性质的初步研究

酸碱适应性:分别用 0.1mol/L的 HCl和0.1mol/L NaOH 溶液以10% 的浓度来处理代谢物.30min后,再分别用相同浓度的 0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L HCl来调整pH值至中性.以未经处理的代谢物为空白对照,设立3个平行实验,用滤纸片法来测定代谢物的溶藻率.

热稳定性:将代谢物于90℃热激15min,同样以未经处理的代谢物为空白为找,设立3个平行实验,用上述方法来测定代谢物的溶藻率.

分子量大小:将 200µL代谢物移入分子截流量为 5kD的超滤离心管中,以最大速率离心15min.将滤出液和截流液同时进行固体溶藻试验.

2 结果

2.1 溶藻细菌的分离

从采集到的水样里分离出 10多种单菌落,分别进行液体溶藻试验,从中挑选出一株溶藻效果最佳的菌株,将其暂时命名为JZ-1.

2.2 细菌生理生化及分子生物学鉴定

菌株JZ-1在MB琼脂培养基上的菌落呈圆形,表面光滑,不透明.革兰氏阴性菌,无芽孢,能够水解淀粉.具体生理生化结果如表1所示.

PCR扩增产物的长度为1372bp,用Blast程序对JZ-1的16S rDNA序列和GenBank中已登陆的16S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比较,结果发现,与多株交替单胞菌的同源性极高,再结合生理生化指标可以推断出,实验菌株属于交替单胞属(Alteromonas).

表1 菌株JZ-1的生理生化特征Table 1 The physiological characteristics of strain JZ-1

2.3 液体溶藻试验

细菌培养液对中肋骨条藻生长影响的情况如图1所示,对照组中的中肋骨条藻由对数生长期至稳定期过渡,完整的藻细胞数持续上升;与对照组相比,处理组的完整藻细胞数在整个培养期呈显著下降现象.至第10d为止,细菌培养液的溶藻率高达95.67%.

图1 细菌培养液对中肋骨条藻的影响Fig.1 The effects of bacterial culture against Skeletonema costatum

2.4 荧光显微镜下观察藻细胞变化

在菌株JZ-1的培养液作用下,中肋骨条藻藻细胞发生了一系列的改变(图2).图2a显示的是正常情况下健康的中肋骨条藻细胞形态:具有完整的细胞膜,且膜内物质齐全无损坏,在荧光显微镜下颜色鲜明,呈现特定的形状.8h后,有些细胞依然保持完整的状态,但有些细胞开始发生变化(图2b):膜内物质开始改变,在荧光显微镜下呈现出颜色不鲜明,并有些浑浊的状态.16h后,绝大多数藻细胞的形态都已改变,膜内物质更加浑浊(图2c).图2d描述的是24h后的藻细胞形态,这时不但膜内物质浑浊,而且细胞膜开始破裂,致使胞内物质外漏,藻细胞彻底死亡.

图2 荧光显微镜下菌株JZ-1对中肋骨条藻藻细胞形态的作用观察Fig.2 The Fluorescence microscopic observations of S. costatum in cultures with strain JZ-1

2.5 溶藻机理的探讨

图3 不同处理方式下的JZ-1菌株对中肋骨条藻的影响Fig.3 The effects of strain JZ-1 treated with different methods against S. costatum

图3所示的是菌株JZ-1经过不同方式处理后对中肋骨条藻藻细胞的溶解作用.在菌株经不同方式处理后的第 2d,对比空白对照,经过细菌培养液、上清液、细菌过滤液处理的中肋骨条藻的藻细胞数均已发生变化:空白对照的藻细胞数达到 17.6×105个/mL;而经细菌培养液的上清液和过滤液的作用后的中肋骨条藻的藻细胞数分别降至13.5×105个/mL,13×105个/mL和11.5×105个/mL.但经菌体沉淀作用下的藻细胞数也达到了17×105个/mL,与空白对照相比差异不显著.在从第2d至第10d的培养期内,菌体沉淀处理的中肋骨条藻藻细胞数始终与空白对照的藻细胞呈现大致同样的增长速率,而细菌培养液、上清液与过滤液作用下的中肋骨条藻藻细胞数一直呈现持续下降现象,且下降程度大致相同.

2.6 代谢物溶藻试验

如图4所示,菌株JZ-1的代谢物的溶藻效率与其所处的细胞生长周期有一定的关系.在细菌细胞生长的迟缓期内,代谢物对中肋骨条藻的藻细胞没有溶解作用.而从第 2d开始,当菌株细胞处于对数生长期初始阶段时,这时所提出来的代谢物表现出一定的溶藻作用,而随着菌株细胞个数的增加,代谢物的溶藻率也随之提高,直至第3d,菌株由对数生长期向稳定期过渡的时刻,代谢物的溶藻效率达到最大 76.4%.而随着菌株进入稳定期,代谢物的溶藻率却随之下降.

图4 菌株JZ-1的代谢物的溶藻效率与细胞生长周期的关系Fig.4 The algicidal rates of metabolites extracted at different growing phase

2.7 代谢物性质的初步研究

根据图4所示,发现培养3d后的藻液所提出的代谢物的溶藻率最高,所以用此时提出的代谢物来进行下面试验.

酸碱适应性:经过 0.1mol/L的 HCl和0.1mol/L NaOH 溶液处理后的代谢物的溶藻率对比未经任何处理的代谢物的溶藻率发生显著变化(图5).经过0.1mol/L的HCl溶液处理的代谢物的溶藻率降低至 11.2%,对比空白对照降低了65.6%.而经过 0.1mol/L NaOH 溶液处理后的代谢物没有表现出任何溶藻作用.

热稳定性:将代谢物于90℃热激15min,以除去其中在高温下变性的物质,剩下的物质具有热稳定性.用滤纸片法同时测定经过高温和没有经过高温处理的代谢物的溶藻率,发现没有经过高温处理的代谢物的溶藻率达到 76.8%,而经过高温处理的代谢物的溶藻率也高达 74.8%,对比空白对照没有显著差异.

图5 酸碱处理后的代谢物的溶藻率Fig.5 The algicidal activities of metabolite with and without acid and alkaline

分子量大小:分子截流量为5kD的超滤离心管将所提出的代谢物分离成两部分,一部分物质的分子量＞5kD,另一部分物质的分子量＜5kD.根据固体溶藻试验发现,分子量＞5kD的那部分物质没有溶藻现象,而在添加分子量＜5kD的物质的滤纸片周围有明显的大范围抑藻圈,说明菌株JZ-1的溶藻活性物质分子量＜5kD.

3 讨论

近年来,许多溶藻细菌[19-23]从不同的水源中被分离出来,而且关于研究中肋骨条藻爆发的机理和对环境产生危害的文章不少,但目前关于抑制中肋骨条藻生长的溶藻细菌的报道却并不多见[24].本实验室从胶州湾分离了几株溶藻细菌,并选取了其中溶藻效果最佳的菌株JZ-1作为重点研究对象.根据生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定得出JZ-1菌株属于交替单胞菌属的结论.根据报道,Shinya等[25]从东京一个富营养化池塘中分离出一株命名为X82145的交替单胞菌菌株;彭超等[26]也从武汉一个池塘出分离出一株对铜绿微囊藻有显著溶解效果的溶藻细菌,此菌株亦属于交替单胞菌属.由此可见,交替单胞杆菌在抑制有害藻类爆发过程中有着重要的作用.

菌株JZ-1对实验中所用的中肋骨条藻有着明显的溶解作用,能够有效地破坏中肋骨条藻细胞的内部结构和藻细胞膜的完整性,使得胞内物质流出,致使藻细胞破裂死亡.溶藻细菌抑藻大体是通过直接溶藻和分泌活性物质间接溶藻两种方式[15,20].为了弄清楚 JZ-1菌株的溶藻方式,对细菌及其培养液进行离心、过滤等处理,并分别将各种处理进行溶藻试验.结果发现,菌株 JZ-1能够溶解中肋骨条藻,但这种溶解作用发生在细菌培养液的上清液和0.2µm的过滤液中,而细菌的菌体对中肋骨条藻无任何影响.这些结果表示菌株JZ-1是通过分泌有效的活性物质来显示溶藻活性的,其溶藻方式属于间接溶藻方式.

为了进一步验证上述结论,利用离子交换树脂来提取细菌的分泌代谢物,并结合细菌生长的不同阶段,采用滤纸片法来进行代谢物的固体溶藻试验.结果发现,菌株JZ-1在对数生长期和稳定期所产生的代谢物对中肋骨条藻的生长都产生一定的抑制作用;而其中在菌株由对数生长期向稳定期过渡的时刻,代谢物的溶藻效率达到最大.

针对代谢物的性质,做了3项测试:酸处理后的代谢物的溶藻率比空白对照降低了 65.6%,而碱处理后的代谢物没有表现出任何溶藻作用.这表示此代谢物有一定的耐酸性,但却不耐碱;热激后的代谢物仍然对中肋骨条藻有抑制作用,且溶藻率对比空白对照没有显著差异表明此代谢物具有热稳定性;分子截流量为5kD的超滤离心管将所提出的代谢物分离成两部分,在分子量＜5kD的物质的滤纸片周围有明显的大范围抑藻圈,说明菌株JZ-1的溶藻活性物质分子量＜5kD.

4 结论

4.1 菌株 JZ-1对中肋骨条藻有很好的溶解效果, 按10%的体积比进行溶藻试验,发现10d内,细菌培养液的溶藻率高达95.67%.菌株破坏藻细胞的内部结构和藻细胞膜的完整性, 使得胞内物质流出,致使藻细胞破裂死亡.

4.2 菌株 JZ-1通过分泌代谢物进行溶藻,属于间接溶藻.

4.3 当菌株 JZ-1由对数生长期向稳定期过渡时,代谢物的溶藻效果最好.

4.4 菌株 JZ-1的代谢物具有一定的耐酸性,但却不耐碱;具有热稳定性;分子量＜5kD.

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Lysis effect and mechanisum of one bacterial strain on Skeletonema costatum.

WANG Hui, LIU Ling, NIU Dan-dan, LIU Zhao-pu*(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Jiangsu Province, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2011,31(6)：971～977

A strain of marine algae-lysing bacterium designated as JZ-1 was isolated from Jiaozhou Bay, China. Strain JZ-1 showed highly homology with Alteromonas sp. on the basis of morphological and biochemical characteristics and16S rDNA sequence analysis. Strain JZ-1 showed significant algicidal activity against Skeletonema costatum, it broke the materials structures in membrane and membrane integrity, and the materials leak through membrane to make the cells die. In addition, algicidal activity against S. costatum was detected in the filtrate and after filter through 0.2 µm syringe filter, not in the cells. Strain JZ-1 effects S. costatum by releasing certain algicidal substances, and this point was also confirmed by paper disk method. The metabolite had the highest algicidal activity at this moment when the bacterium transited to stationary phase from logarithmic growth phase. We tested some characteristics of the metabolite and the results were as follows: the molecular weight of metabolite was＜5kD; the metabolite had certain acid tolerance but no alkali tolerance; the metabolite had thermal stability.

water bloom；Skeletonema costatum；algae-lysing bacterium；algicidal mode

X172

A

1000-6923(2011)06-0971-07

2010-10-07

国家“十二五”科技支撑计划(2011BAD13B09);国家自然科学基金资助项目(30600086)

* 责任作者, 教授, sea@njau.edu.cn

汪 辉(1985-),女,山东烟台人,南京农业大学江苏省海洋生物学重点实验室博士研究生,主要从事微生物和藻类的环境生物学研究工作.发表论文6篇.