覆盆子乙醇提取物促进皮肤屏障修护的研究

赵 婷，唐 蓉，邵 雪，刘俊红，权强华，2，安 全，2**

(1.云南白药集团健康产品有限公司，云南 昆明 650000；2.东亚健康肌肤研究中心，北京 100000)

传统药用的覆盆子为蔷薇科悬钩子属掌叶覆盆子(Rubuschingii)的果实，始载于《本草经集注》，主产于我国华东地区(浙江、福建两省)，故又被称为华东覆盆子。其味甘、酸，性温；归肝、肾、膀胱经。具有益肾固精缩尿、养肝明目的作用，用于遗精滑精、遗尿尿频、阳痿早泄、目暗昏花等[1]。覆盆子中主要成分包括黄酮及其苷类、萜类、生物碱类、挥发性化合物、香豆素类、甾醇类、酚酸类、多糖、芳香性化合物等，其中以山柰酚-3-O-芸香糖苷和鞣花酸为其典型成分[2]。现代药理学研究显示覆盆子中的黄酮苷类等化合物具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗衰老和美白等功效[3-8]。

当皮肤受到如烧伤、烫伤等损伤时，角质形成细胞通过细胞迁移到达损伤部位，通过大量增殖细胞、分泌细胞因子和生长因子，使得损伤部位得以治愈，故角质形成细胞的迁移能力对表皮损伤修复具有重要作用[9-10]。角蛋白是表皮的主要结构蛋白，也是角质形成细胞的标志成分。角蛋白(keratin)不同阶段的表达代表了表皮细胞分化的不同阶段，K1是在角质化过程中合成的第一个蛋白，K1和其异质二聚体角蛋白K10是表皮基底上层角质形成细胞的主要角蛋白，当细胞上升至棘细胞层即可发生特异性的表达，K1基因的表达能反映表皮细胞的分化能力[11-13]。兜甲蛋白(loricrin，LOR)是角质形成细胞分化的终末产物角质化包膜(comified envelope，CE)组装过程的关键成分，约占CE含量的80%，对皮肤屏障起加固作用[11]。CE相关蛋白的形成与角质形成细胞的增生和分化密切相关，只有当前者的正常基因编码表达和后者之间达到精准平衡，表皮才能正常形成并角质化，LOR基因的表达能反映表皮细胞的分化能力[14]。

当表皮长期受到如紫外线(UVB)照射等损伤时，角质层的角蛋白和兜甲蛋白(LOR)的表达量会降低，且角质层的水合能力下降[15]，故提高角蛋白K1和LOR对皮肤屏障修护有着重要作用。许多研究显示，植物提取物及其主要成分可显著提高角蛋白、兜甲蛋白等皮肤屏障相关蛋白的表达。茶多酚的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯的类脂质体可提高角蛋白的水合作用[16]。黄芩(Scutellariabaicalensis)中的黄芩素(Baicalein)能通过激活TRPV4受体增加HaCaT角质形成细胞中角蛋白1/10的表达[17]。此外，2% 青刺果(Prinsepiautilis)油可通过增加角化套膜LOR等蛋白及酶的 mRNA 表达来修复受损表皮通透屏障[18]。魁蒿(Artemisiaprinceps)和梨果仙人掌(Opuntiaficus-indica)提取物也可提高LOR的表达，以此促进皮肤屏障修复[19-20]。本文拟对覆盆子提取物在K1和LOR表达方面进行研究，进一步探索其对皮肤屏障修护的作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CSJ-60粗碎机(江阴市方圆机械制造有限公司)、TQ-SH多功能提取罐(温州市神华轻工机械有限公司)、AX4202ZH/E电子分析天平(常州奥豪斯仪器有限公司)、WZ单效外循环蒸发器(浙江金安制药机械有限公司)、LYQ-1冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司)、Waters高效液相色谱仪(Waters e2695)、150iCO2培养箱(Thermo)、SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、CKX41倒置显微镜(Olympus)、CFX-96荧光定量 PCR 仪(BioRad)等。

1.2 药材

覆盆子(RubuschingiiHu)的干燥药材，购自河北安国朋茂中药材经营有限公司，经鉴定为正品覆盆子。

1.3 试剂

KC2500培养液(博溪生物)、二甲基亚砜DMSO(Sigma)、噻唑兰MTT(Sigma)、反转录试剂盒(Takara)、RNAiso Plus(Takara)、荧光染料(Takara)、氯化钙CaCl2(Sigma)、表皮细胞生长因子EGF(博溪生物)、乙醇(耿马南华华侨糖业有限公司)、乙酸乙酯(重庆万盛川东化工有限公司)等。

1.4 细胞

本文所用细胞为角质形成细胞，批号：21072702，均由广东博溪生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 覆盆子提取工艺

将覆盆子干燥粉碎后称取 400 g 覆盆子粉末，加入质量分数75%乙醇 4 L(料液比1∶10 g/L)进行回流提取，提取时间为 1.5 h，减压抽滤，滤渣用 4 L 质量分数75%乙醇(料液比1∶10 g/L)回流提取第二次，减压抽滤，合并两次滤液，在 60 ℃ 减压浓缩至无醇味，得到约 500 mL 浓缩液，浓缩液用乙酸乙酯萃取2次，保留水层，在 60 ℃ 减压浓缩，冻干，得到覆盆子水层提取物(样品名：ZS29)。利用仪器操作条件、实验检测条件得到提取物的指纹图谱，利用比色法得到提取物的多糖含量。

2.2 细胞毒性测试

按8×103个/孔的接种密度接种角质形成细胞至96孔板，放置于 37 ℃、5% CO2环境的培养箱中孵育过夜。共四组实验(空白调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组)。样品组设置8个质量浓度梯度，每个质量浓度设置3个重复孔。细胞毒性测试浓度设置8个质量浓度梯度(0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.00313、0.00156、0.0078 mg/mL)配制不同浓度的样品工作液。给药时间为已接种细胞的96孔板中达到40%～60%的细胞铺板率时。①空白调零组不接种细胞，给药 200 μL/每孔细胞培养液；②溶剂对照组给药 200 μL/每孔培养液；③阳性对照组给药 200 μL/每孔含质量分数10%二甲基亚砜DMSO的培养液；④样品组给药 200 μL/每孔含有不同浓度样品的培养液。完成给药后，将四组实验的所有96孔板放置在 37 ℃、5% CO2环境的培养箱中，培养时间为 24 h。24 h 后，取出96孔板，丢弃上清液，加入 5 mg/mL 噻唑兰MTT，之后在 37 ℃ 避光环境中孵育 4 h，孵育结束后，丢弃上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亚砜DMSO，在 490 nm 处读取四组实验不同OD值。细胞相对活力计算公式为：

2.3 细胞划痕测试

在6孔板接种细胞，接种密度为5.5×105个/孔，在37℃、5%CO2环境的培养箱中孵育过夜。阳性对照EGF 1 ng/mL，样品组浓度为无细胞毒性的浓度范围。给药时间为6孔板中达到90%左右的细胞铺板率时，给药量为 2 mL/每孔，每组设置3个重复孔。在 37 ℃、5% CO2环境的培养箱中继续孵育 24 h。孵育结束后，进行细胞划痕实验。用 5 mL 枪头在6孔板中纵向划两道，竖痕作为基线，划完竖痕后，垂直于基线，在6孔板中轴线附近水平划痕。细胞划痕结束后，用磷酸缓冲盐溶液PBS对细胞进行3次清洗，清洗完成后加入细胞培养液，在 37 ℃、5% CO2环境的培养箱中培养 24 h。细胞划痕实验结束后立即在4倍镜下拍照，划痕实验结束 24 h，用磷酸缓冲盐溶液PBS进行清洗，清洗之后在4倍镜下拍照。

2.4 基因测试

2.4.1 引物序列

1)LOR基因。F:5′-TCATGATGCTACCCGAGG TTTG-3′;R:5′-TGCAAATTTATTGACTGAGGCAC TG-3′。

2)K1基因。F:5′-AGATCACTGCTGGCA GACATGG-3′;R:5′-TGATGGACTGCTGCAAGTTGG-3′。

2.4.2 测试方法

在6孔板接种细胞,接种密度为2×105个/孔,在37 ℃、5% CO2环境的培养箱中培养过夜。阳性对照CaCl2浓度0.3 mmol/L,样品组浓度为无细胞毒性的浓度范围。给药时间为6孔板中达到40%～60%的细胞铺板率时,给药量为2 mL/每孔,每组设3个复孔,37 ℃、5% CO2环境的培养箱中培养24 h。细胞培养24 h后,丢弃上清液,使用PBS1mL/每孔分别清洗细胞两次,加入1 mL/每孔 RNAiso Plus,在细胞吹打裂解后,收取样品。提取目标基因(K1、LOR)的RNA,反转录,得到cDNA,qRT-PCR检测,使用2-△△CT方法计算结果。

2.5 结果统计分析

使用软件GraphPad Prism绘图,结果表示为Mean±SD。采用t-test统计分析各组数据。统计分析均为双尾。当P<0.05差异显著,当P<0.01差异极显著。

3 结果

3.1 覆盆子提取物

经过以上工艺提取,得到覆盆子水层提取物(样品号:ZS29)55.4 g,收率13.85%,多糖含量17.67%。覆盆子水层提取物指纹图谱见图1。

图1 覆盆子水层提取物HPLC指纹图谱

3.2 细胞毒性实验结果

8个给药浓度的覆盆子水层提取物样品ZS29,使用角质形成细胞进行样品细胞毒性检测,细胞活力变化MTT检测结果见表1,细胞形态学图片如图2所示。

表1 覆盆子水层提取物样品ZS29作用于角质形成细胞MTT结果汇总表

图2 覆盆子水层提取物样品ZS29作用后的细胞形态学图

根据MTT和形态学结果,认为覆盆子水层提取物样品ZS29基于角质形成细胞,在0.00625 mg/mL的质量浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。

3.3 细胞划痕实验结果

归一空白对照组(BC)迁移率,以此为基础,计算每组相对迁移率,细胞迁移图片见图3,细胞迁移数据结果见表2。

表2 细胞迁移数据结果

图3 细胞迁移图

与BC组相比,阳性对照组(PC)的细胞相对迁移率显著上升,表明此次实验阳性设置有效;与BC组相比,样品ZS29在质量浓度为 0.00625 mg/mL 和 0.00156 mg/mL 时的细胞相对迁移率稍有提高。

3.4 基因检测结果

3.4.1LOR基因检测结果

与BC组相比,PC组基因LOR的表达量明显提升,表明此次实验阳性设置有效。与BC组相比,样品ZS29在质量浓度为0.00625、0.00313、0.00156 mg/mL 时,对基因LOR的表达量有明显的提升作用(P<0.01),提升率分别为2732.99%、851.91%、542.33%(表3)。

表3 LOR基因扩增检测结果

3.4.2K1基因检测结果

与BC组相比,PC组基因K1的表达量明显提升,表明此次实验阳性设置有效。与BC组相比,样品ZS29在质量浓度为0.00625、0.00313、0.00156 mg/mL 时,对基因K1的表达量有明显的提升作用(P<0.01),提升率分别为286.04%、185.15%、179.52%(表4)。

表4 K1基因扩增检测结果

4 结论

基于角质形成细胞,与对照组相比:

覆盆子水层提取物(样品ZS29)在质量浓度为 0.00625 mg/mL 和 0.00156 mg/mL 时的细胞相对迁移率稍有提高,但作用并不明显。

覆盆子水层提取物(样品ZS29)在质量浓度为0.00625、0.00313、0.00156 mg/mL 时,对基因LOR的表达量有明显的提升作用,提升率分别为2732.99%、851.91%、542.33%,对基因K1的表达量有明显的提升作用,提升率分别为286.04%、185.15%、179.52%。

覆盆子水层提取物可通过提升LOR、K1基因的表达量,促进细胞代谢,达到修护皮肤屏障功效。