不同磷源对枯草芽孢杆菌生长的影响

李文飞，王凤霞*，胡国涛，杨晓健，张 丹

（1.中低品位磷矿及伴生资源高效利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550016；2.瓮福（集团） 有限责任公司，贵州 贵阳 550000）

微生物在生长繁殖过程中需要碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水分六大营养物质，而无机盐主要可为微生物提供除碳源、氮源以外的各种重要元素，在微生物发酵的作用是构成菌体细胞成份，作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂，调节培养基的渗透压、pH、氧化还原电位等，对发酵菌体的影响效果虽不及碳源和氮源，但适量的添加可促进菌体健康快速的生长繁殖，提高其代谢产物量[1～2]。磷常以磷酸盐的形式加入到培养基中，据市场调研，在微生物发酵工业化生产过程中，考虑到用量大，混合难度等问题，大部分微生物发酵厂家多使用食品级磷酸代替磷酸盐。因此，磷酸也可为对微生物生长及发酵提供磷源。

《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[3]（GB2760-2014） 中食品工业用加工助剂使用中明确规定，磷酸可作为食品工业用加工助剂（发酵用营养物质）在发酵工艺上使用。而根据生产方式的不同，市面上磷酸产品又分为热法磷酸（Thermal method phosphoric acid,以下简称 TPA）和湿法磷酸 （Wet phosphoric acid，简称 WPA）两类。由于WPA杂质较多需经净化处理后才能达到与热法磷酸相同品质，由此产生了湿法净化磷酸产品（Purified Wet Phosphoric Acid,以下简称PPA）。为探究磷源对枯草芽孢杆菌生长及代谢的影响，本试验选取了以磷酸盐形式添加的磷源、以湿法净化磷酸形式添加的磷源、和以热法磷酸形式添加的磷源，添加入枯草芽孢杆菌培养基中进行相关验证试验。

1 实验部分

1.1 原料及试剂

试验菌种：枯草芽孢杆菌（贵州大学生命科学学院菌种保存室提供）。

试剂：食品添加剂湿法磷酸（85%）、食品添加剂热法磷酸（85%）、磷酸二氢钾、酵母粉、蛋白胨、琼脂、牛肉膏、氢氧化钠，氢氧化钾、碳酸钙、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、可溶性淀粉、碘粒、碘化钾等，以上试剂均为分析纯。

培养基及试剂配制：《微生物学实验教程（第四版）》[4]进行配制。

LB基础培养基（蛋白胨10g、酵母提取物5 g、葡萄糖5g、氯化钠10g、琼脂10g、碳酸钙0.25g，加纯水至 1000mL，pH调节 7.2～7.4（1mol/L氢氧化钠调节） 121℃，高压灭菌30min）。LB磷酸盐培养基（在基础培养基中添加磷酸二氢钾0.35g），LB磷酸培养基（在基础培养基中添加磷酸0.29g，氢氧化钾0.15g)

淀粉培养基：可溶性淀粉2g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、琼脂20g，加纯水至1000 mL，调节 pH至 7.0（1mol/L氢氧化钠调节）121℃，高压灭菌30min。

固体培养基配制：按照以上配方，每1000mL培养基中加入即可。

1.2 主要仪器和设备

精密天平；立式压力蒸汽灭菌锅（BXM-30R）；恒温振荡培养箱 (DHP-9052B)；超净工作台（带紫外灯）；偏光显微镜；石墨加热板（DBXAB）；紫外可见分光光度计（PE Lambda）等。

1.3 实验方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌固体培养

用接种针挑取已活化好的枯草杆菌点接于LB基础培养基、LB磷酸盐培养基、LB热法磷酸培养基、LB湿法磷酸培养基中间，倒置于37℃培养箱中培养48h后用游标卡尺测量单菌落直径大小。

1.3.2 枯草芽孢杆菌液体培养

微生物类生长状况可根据发酵液中细胞含量（通常采取比浊法进行OD值检测，OD值与细胞含量成正相关）进行判断。

1）取活化好的菌落斜面一支，以1mL0.9%生理盐水冲洗菌苔，待完全冲洗干净后，吸取1mL接种到250mL LB液体基础培养基中，置于37℃、120 r/min的恒温培养振荡器，培养24h即得酵母种子液。

2）各试验组的LB液体培养基配制好后按照试验要求分装于500mL三角锥瓶中，每瓶250.00g，标注后灭菌备用。

3）接种种子液。按接种量为4%接种于三角锥瓶中，置于37℃、120 r/min的恒温培养振荡器培养48h。

4）生长量测定。采用比浊法进行测定。以未接种的LB液体培养基作为空白对照，在波长600 nm条件下，测定OD值。

1.3.3 枯草芽孢杆菌产酶能力[5]

枯草芽孢杆菌在代谢繁殖过程中能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶、木聚糖酶等十几种酶而具有很强的降解活性。本试验选取淀粉酶进行检测，以透明圈直径大小做为检测指标，用以验证不同培养基培养的枯草芽孢杆菌在产蛋白酶能力上是否存在影响。将试验1.3.1中在四种固体培养基上培养出的菌落使用接种针点接于淀粉培养基上，倒置于37℃培养箱中培养72h。通过淀粉培养基观察产淀粉酶的能力，该培养基一般无色透明，滴加卢哥氏碘液，轻摇平皿，使碘液铺满培养基表面，等待片刻，培养基中未被降解的淀粉酶遇碘变蓝，菌落周围淀粉被降解的地方出现透明圈，最后采用游标卡尺测量菌落及透明圈直径大小。

1.3.4 数据处理方法

采用SPSS17.0软件中对实验数据进行分析，多重比较（LSD）确定组间差异，结果以“均值±标准误”表示，标注相同字母（P＞0.05） 表示无差异，标注不同字母（P<0.05） 表示存在差异，EXCEL软件作表。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌固体、液体培养试验结果

枯草芽孢杆菌固体、液体培养见图1所示。

不同培养基中枯草芽孢杆菌培养结果见表1。

图1 枯草芽孢杆菌固体、液体培养示意图

表1 不同培养基中枯草芽孢杆菌固体、液体培养试验结果

由表1可知，枯草芽孢杆菌培养48h后，不添加磷源、添加磷酸盐、添加TPA、添加PPA的培养基中枯草芽孢杆菌直径分别为7.579mm、10.021mm、11.051mm、11.363mm，比不添加磷源的分别增大2.244mm、3.472mm、3.784mm;发酵液中 OD值分别为 2.452、2.561、2.563、2.556，比不添加磷源的分别增加0.141、0.111、0.104。

2.2 枯草芽孢杆菌产酶能力

由图2、表2可知，从1#、2#、3#、4#固体培养基中挑取的枯草芽孢杆菌在淀粉培养基上的透明圈直径、产淀粉酶菌落直径、产淀粉酶透明圈直径/菌落直径值上不存在显著性差异，由此说明培养基中添加适量磷酸盐、TPA和PPA对枯草芽孢产淀粉酶能力不会产生抑制。

3 结语

通过在枯草芽孢培养基中不添加磷源、以磷酸盐形式添加磷源、以TPA形式添加磷源、以PPA形式添加磷源，培养48h后各指标变化来判断磷源对枯草芽孢杆菌生长的影响。由试验数据可知添加磷源，可促进枯草芽孢生长；而以磷酸盐形式和以TPA、PPA形式添加磷源，都能够为枯草芽孢杆菌的生长提供磷源，且促进效果一致。

图2 枯草芽孢杆菌产酶能力

表2 枯草芽孢杆菌产淀粉酶结果