分析临床基因扩增检验实验室的质量控制

时超杰，朱一帆，李莎莎，何敖林

江苏大学附属昆山医院临床实验研究中心，江苏昆山 215300

PCR 技术是现代分子生物学检测的先进技术之一，现在的分子诊断都基于这项技术。它让人类基因组计划得以于2003 年初步完成，通过基因组分析，科学家们揭示了人类基因的多态性与许多易感疾病的关系，并延伸到了基因工程药物、基因生物芯片、细胞生物工程等的研究。此外，通过个体化的基因组表达分析，还能为个体提供一套疾病诊断、治疗、预后的方案，实现真正的精准医疗，PCR 技术实现了个体化检测[1]。但是，随着技术的迅速发展，外界对于检测结果准确性的质疑也越来越多。一方面，由于PCR 技术本身的高敏感性，操作不当或是微量的污染都极易导致检测结果的假阳性；另一方面，实验室布局不合理、样本管理不当、试剂耗材管理不当、仪器设备状态不良、人员缺乏培训、质控不在控、扩增污染、异常结果处理不当、检测结果报告错误等，这些都是随时可能发生在实验前、中、后期的。最后，细节决定成败，由于实验步骤较多，实验人员容易疏忽出错，实验过程中涉及的各个环节都是需要实验人员认真严谨地去对待，只有这样才能为临床提供更可靠的服务。面对上述这么多的问题，这就要求实验人员在临床检测的工作之前，更要重视实验室的质量管理。

1 实验前的质量控制

1.1 实验室的布局

实验室的布局需要满足《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》等相关规定，确保各个分区独立且专用。

1.2 实验室的设施环境

实验室应该规定人流、物流以及清洁工作的单向流动来防止区间污染。安排实验人员对实验室的空间、照明、能源、温度、湿度等的监测来满足检测工作的环境要求。此外，各个区域都应要有紫外灯的设置，包括固定的吊顶紫外灯以及移动紫外消毒车，以满足实验室防止“基因/核酸”污染的要求。

1.3 实验人员要求

实验室工作人员首先要具备省级或以上卫生和计生行政部门授权的上岗证，再进行内部培训，在充分熟知实验室的工作流程和相关标准化的操作程序后，再对其进行理论和操作考核[2]，尽量避免人员因素导致的结果差异。除此之外，实验室负责人还需要定期组织人员通过培训、自学、会议等多种途径来不断提高实验室质量控制的意识。

1.4 仪器设备管理和维护保养

实验操作离不开仪器设备，因此仪器设备的管理和维护保养，是合格检测结果的基础。实验室的主要仪器设备均需建立档案，主要仪器设备包括PCR 仪、 离心机、移液器、冰箱、涡旋震荡器、生物安全柜、紫外分光光度计等。实验室应对这些相关仪器设备制定校准、维护和保养的制度，规定每日、每周、每月、每年保养维护内容，并进行有效记录。遇到仪器设备出现故障的情况时，及时登记故障记录表，通知上级负责人的同时还需要给设备做好故障的标识以防止他人误用。要改正以往对仪器设备状态问题基本不重视的缺点，要明白定期校准和保养仪器设备对保证日常检测结果准确的重要性。

1.5 试剂管理和质检

对试剂的质检包括内、外包装检查和性能验证。外包装检查：实验人员需要查验试剂的外包装、产品有效期、运输温度等；内包装检查：实验人员需对试剂盒内的说明书、试剂的符合情况等进行检查。试剂的性能验证是重中之重，需设置空白对照、阴性对照、阳性对照和多个上批次已测结果的样本，以此来评估新批次试剂的性能。试剂在实际使用过程中应避免反复冻融，开启或复溶后需及时记录日期和有效期。自配试剂，最好做到现配现用。

1.6 耗材管理

实验耗材是实验顺利进行的基础，实验室对主要耗材查验并登记记录，特别应加强对离心管和滤芯吸头的质检，离心管应进行高温爆管、高速离心完整性试验和是否含有扩增抑制物等的检测，滤芯吸头的密封性需仔细查验。

1.7 标本的管理

实验室根据所开展项目的需要，自行拟定样本采集、转运、接收、拒收、保存等相关制度以确保检测样本的有效性。该院实验室使用全血样本，对采集人员宣教要求使用EDTA 抗凝管采血，严禁使用对PCR 扩增有抑制作用的肝素管。转运过程中要求使用专用低温贮存盒送检，运输过程中应避免血液样本剧烈振荡而导致的溶血。实验室在接收样本时需仔细核对样本基本信息并评估样本的合格性，对不合格的样本，如溶血、脂血、样本量不足、运输时间过长、基本信息不符等进行拒收，记录并与临床取得沟通，对于无法重新采集的标本，在与临床沟通获得知情同意后，方可进行让步检测。将不能及时检测的全血样本放置4℃的冰箱，并保存时间不超过一周；将需要短期贮存的样本置于-20℃的冰箱，并保存时间不超过一个月；将完成实验需要长期保存的样本置于-80℃的冰箱，以备复检。此外，由于实验室在日常工作中样本量较大，为了避免样本间的混淆，还需要引入样本唯一性编号的管理程序[3]，以便于样本的核对与查找。

2 实验中的质量控制

2.1 室内质控

室内质控指的是实验人员通过连续监测实验室常规工作的精密度，确保工作中批内、批间样本检测结果的可靠性，从而来确定检测结果能否发放的一项重要工作[4]。一般选用阴性和弱阳性质控品进行监测，阴性质控品为无模板对照，需要将其包含在整个扩增检测步骤中，以证明样本、试剂及整个操作平台中没有核酸的污染。弱阳性质控品应包括所有突变位点，在日常监测中只需加入一个已知突变，以后每批次检测中逐步涵盖所有突变位点，注意最好每次将质控品的扩增位置进行顺延以保证每个扩增孔的有效性和稳定性。对于室内质控出现问题的情况，需要建立起应对方案，包括查出异因、采取措施、保证消除、不再出现、纳入标准来防止同样情况的再次发生。

2.2 室间质评

室间质评是采用一些外部办法来评价实验室检测结果的准确性，旨在提高实验室的检测能力[5]。这些外部办法有：①积极参与省临检中心组织的室间质评活动，按照要求及时检测并上报结果，对于反馈的不足之处需要认真改正。②如果实验室所开展的项目并不在省临检中心组织的范围内，可以考虑参加国家组织的质评活动，同样需要认真对待反馈的结果并及时改善。③如果上述两种质评活动都未能及时参与，实验室应与同级别或是更高级别实验室进行实验比对，操作流程应与国家和省级组织的活动相同。室间质评不是为了应付考察，而是真真切切地对于实验室检测能力的认证，将不同实验室的结果变得具有可比性，才能使实验室发出的结果更有保障[6]，也是对实验人员综合素质能力的认定。

2.3 污染监测及排除

介于PCR 技术的高敏感性，更需要将防污染的理念贯穿于整个检测过程中，并认真落实。PCR 实验室的污染来源主要包括了试剂污染、标本之间的交叉污染、PCR扩增污染、质粒污染等[7]。应对这些棘手的问题，首先要做到实验室布局合理，对实验区内的所有设备、耗材进行标识，避免不同区域间混用带来的污染。其次，在实验前应先打开紫外灯对实验环境消毒30 min 来消除残留的核酸。在实验中如果发生污染，应对污染的地方使用2 000 mg/L 的次氯酸钠溶液进行擦拭，等作用30 min后，再用蒸馏水和75%的乙醇擦拭2 遍，最后打开紫外灯照射1 h[8]。在实验后，对实验过程中丢弃的枪头、反应管等有污染风险的耗材应在2 000 mg/L 的次氯酸钠溶液中浸泡过夜，实验样本按照医疗废弃物的生物安全要求进行消毒处理。对实验室的地面、操作台面及仪器设备使用1 000 mg/L 含氯消毒液进行清洁，配合紫外灯照射30 min 以上[9]。此外，应加强阴性、阳性对照在每次试验中监测污染的应用分析，其中要强调的是对照样本需要参与整个检测流程，以确保能监测任何可能带来污染的环节，同时需要定期组织实验人员进行防污染理论与实践学习，来提高规范化操作的能力，确保检测结果的准确性。

3 实验后的质量控制

3.1 结果报告、解释及临床沟通

由于基因扩增检验项目还处在发展阶段，这给临床医生解释报告与治疗的相关性提出了难题。因此，对于检测报告的信息内容要求更加详细，除了有患者基本的相关信息外，还应要有唯一性编号、样本的质量评价、检测方法、检测仪器、方法的局限性以及最新的临床意义等。随着结果报告的不断完善，临床对于检测项目与治疗的相关性也将有更好的理解。此外，实验室还需加强与临床的主动交流沟通[10]，如遇到样本信息不符、检测结果与临床实际表现不符等情况，应主动查找原因，了解相关病史，给临床提供进一步检查与治疗的意见。只有这样，将临床与医技紧密地联系在一起，才能给患者带来最优质的诊疗服务[11]。

3.2 异常结果处理

实验室若出现扩增失败、较难判读的结果、质控不在控等异常情况，需要有自己的应对措施。一般的应对措施有：①重新确认样本是否符合检测的要求。②对确认有效的样本进行重测，尽量避免人为因素、试剂因素、仪器设备因素等导致的异常。③仔细排查实验室是否存在污染而导致扩增异常。④对于可疑的结果，应使用数字PCR、基因芯片、基因测序等特异性和灵敏度更高的方法进行验证，做好记录并定期总结归纳[12]。可以将日常经验写成标准化的处理操作文件，实验人员需要认真执行并在日后的工作中不断优化标准文件。异常结果的妥善处理是对实验室质量控制能力的考验，是实验室进一步发展的必经之路。

3.3 记录保存与管理

实验人员应将实验过程中涉及的样本唯一性编号、检测试剂的来源和批号、核酸的纯度与浓度、样本检测结果等相关情况进行认真记录，在每日工作完成后及时整理归档，定期对这些记录数据进行分析比对，保证批内、批次间的检测差异越小越好。如在分析中发现了问题，需要及时组织科内会议，仔细研讨可能导致的原因并及时验证与纠正。总之，做好实验室记录不仅能够规范实验操作、提高工作效率，还能为建立标准化、规范化的实验室管理体系奠定基础[13]。

4 总结

目前，临床基因扩增检测技术以其灵敏度高、特异性强、简便快捷、可定性和定量检测等优势，已经广泛应用于个体化药物治疗、产前筛查、肿瘤多基因检测、感染性疾病检测等多个领域[14]。这项技术使得实验室在临床医疗决策地位提升的同时，也给实验室提出了更加严格的要求。这就要求实验人员在日常的工作中，需要时刻谨记质量第一的理念，严格遵守实验室的相关制度章程，规范操作并不断总结经验，进一步加强与临床的沟通交流，让实验室能更好地服务于临床。