HIV抗体酶联免疫试验结果的影响因素研究

何凤媛 谭博 赵琳 李贵华

[摘要] 目的 探讨抗人免疫缺陷病毒（HIV）酶联免疫试验结果的影响因素，提高筛选检查准确性，为艾滋病的防控工作提供快速准确的科学依据。方法 抽取2017年间送检至实验室的患者血清样本300例，进行回顾性分析，采用酶联免疫试验进行初筛选，由市疾控中心对其进行确认，同时对试验中所用试剂、标本、操作进行详细分析。结果 在检测的样本中，上报20例，确认阳性15例，确认阴性4例，1例为HIV抗体不确定。结论 临床应严格按照试剂盒说明书以及试剂操作要求规范试验操作，提高酶联免疫试验检测HIV筛选准确率，确保实验前后质量控制。

[关键词] 酶联免疫试验;人类免疫缺陷病毒;影响因素;质量控制

[中图分类号] R512 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2019）08（a）-0020-03

Study on the Influencing Factors of the Results of HIV Antibody-linked Immunosorbent Assay

HE Feng-yuan， TAN Bo， ZHAO Lin， LI Gui-hua

Chengdu Pidou District Center for Disease Control and Prevention， Chengdu， Sichuan Province， 610000 China

[Abstract] Objective To investigate the influencing factors of anti-human immunodeficiency virus（HIV） enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， improve the accuracy of screening and examination， and provide a fast and accurate scientific basis for the prevention and control of AIDS. Methods A total of 300 patients with serum samples sent to the laboratory during 2017 were selected for retrospective analysis. The initial screening was performed by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， which was confirmed by the Municipal CDC. At the same time， the reagents， specimens and operations used in the test were used and a detailed analysis was implemented. Results Of the samples tested， 20 case were reported， 15 case were positive， 4 case were negative， and 1 case was HIV antibody. Conclusion The clinical practice should be strictly in accordance with the instructions of the kit and the operation requirements of the reagents， and the accuracy of HIV screening should be improved by enzyme-linked immunoassay to ensure the quality control before and after the experiment.

[Key words] Enzyme-linked immunosorbent assay; Human immunodeficiency virus; Influencing factors; Quality control

艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），又名獲得性免疫缺陷综合征，是由感染艾滋病病毒（HIV病毒）引起。据中国疾控中心、联合国艾滋病规划署、世界卫生组织联合评估，截至2018年底，全人群艾滋病病毒感染率约为9.0/万，估计新发感染者每年8万例左右，感染者增加速度没有减慢，准确并且快速检测艾滋病十分重要。目前，常用方法初筛方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光或免疫荧光试验、快速检测（RT）及其他检测试验。其中ELISA试剂盒使用最为广泛，它具有准确性高、价格低廉、判断结果又客观标准、结果便于记录和保存等优点[1]。但酶联免疫试验需大量手工操作，因此易受到多种因素影响，导致结果存在偏差。为了进一步提高酶联免疫试验检测准确性，该文对HIV抗体酶联免疫试验结果的常见影响因素进行分析，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

抽取2017年间送检至实验室的患者血清样本300例。

1.2  方法

所有患者均于清晨采取3～5 mL静脉血，尽量避免溶血，非抗凝血自然凝固1～2 h后，以3 000 r/min离心15 min，分离血清，制备标准，监测24 h。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照。经过1 h的孵育，然后洗板，加底物，30 min避光反应后加终止液即完成反应部分。使用北京万泰试剂以及深圳爱康全自动酶免仪，在实施检测过程中，根据试剂使用说明书以及仪器操作指导进行操作，提高质量管控力度。当检测结果显示阴性，则出具详细阴性报告;当显示阳性，则应将检测结果送至市疾控中心艾滋病确认实验室进行确认，整个过程做好保密工作。之后读数，由数值来判断结果的阴性或阳性。

2  结果

全自动酶免仪设为2个阴性对照孔，平均OD值不超过0.1，同时2个阳性对照孔OD值不小于0.8，阳性对照孔OD值与临界值相差0.12，当实验检测吸光度不在阴阳限定范围内时，即可对相关原因进行判定，重新检测予以确认。在检测的样本中，上报20例，确认阳性15例，4例确认为试验阴性，1例为HIV抗体不确定。

3  讨论

酶联免疫试验特异性强，灵敏度高，重复性好，但检测结果易受多种因素影响，优质试剂、标准化仪器、规范操作方法、高素质技术人员均是保障试验顺利进行的不可缺少的条件。其中任何一项均可能导致检测结果假阴性或者假阳性的出现，影响后续工作。因此，临床应加强管控HIV抗体初筛查质量，确保结果准确性。经大量临床实践分析[2]，现将影响因素归结为下几方面。

3.1  试剂因素

3.1.1 试剂的选择  检测结果质量是建立在优质HIV抗体试剂基础上的。选择优质试剂考虑因素众多，例如灵敏度、特异性、紧密度、安全性、简单性等，做出全面客观评估，结合实验室具体情况选择灵敏度高、特异性强试剂。实验室应通过厂家详细了解试剂包被物组成成分，包括原料来源、片段组成、片段长短等多项内容[3]，进而判断抗原、抗体包被完整性与特异性，查看试剂批号具体了解试剂质量水平与优劣，客观、合理选择实验室试剂。注意订购长效批号试剂，以免发生批号改变时重建质量管控体系。

3.1.2 试剂的准备  在临床实验中常常忽略了试剂的准备程序，将试剂从冰箱中拿出来便立即使用，而该做法可能影响后续工作步骤时间，这可能导致弱阳性标本出现假阴性结果[4]。实验前因将试剂从2～8℃冰箱取出后放置室温约20～30 min，待试剂盒与室温平衡后再进行检测，使反应微孔中温度满足检测所需，避免试剂温度引起的结果偏差。

3.2  样本因素

①当样本存在严重溶血或混有红细胞血清时，极易附着在聚乙烯孔内，清洗困难，未清洗干净的血红蛋白具有过氧化物酶活性，作用于催化底物造成假阳性，因此，实验室应严格禁止使用严重溶血标本。

②受污染标本中可能含有内源性辣根过氧化物酶，可能导致实验出现特异性显色。因此，酶联免疫试验应采集新鲜标本。如果未能立即进行实验，在5 d之内将试剂放置于4℃保存，若安排1周后检测应在低温下冻存[5]。在收集标本试剂时坚持使用无菌试管，有效防止污染试管。长期未使用试剂反复放置于冰冻保存中，其过程中存生机械剪切力对于蛋白质分子具有破坏力，造成检测结果假阴性。因此，酶联免疫试验应尽量采用新鲜标本，避免长时间反复融冻样本。

③标本凝固不全。正常情况下，采集血液于30 min～2 h开始凝固，在18～24 h开始完全收缩。有时为了争取实验时间，在血液未凝固时便开始进行离心处理，血清中仍残留部分纤维蛋白原。在实验过程中形成明显纤维蛋白块，附着于酶物标孔壁内，不易清洗，导致检测结果假阳性或假阴性。因此，应充分凝固血液标本后再进行分离处理。或者使用带分离胶的采血管采集标本，也可以在采血管中加入适当促凝剂。

3.3  控制方法

①加样。规范加样操作，垂直滴加试剂，禁止出现倾斜、人为加大试剂量。加样吸嘴工具是否干净以及吸取试剂量多少对检测结果准确性具有直接影响。吸嘴构造特殊，清洗困难，极易发生交叉污染。推荐使用一次性吸嘴[6]。定期清洗加样器并做好校准工作。每人均具有1个移液头，以免出现交叉污染。标本加于微孔底部，不可溅出，不可产生气泡。

②温育。96孔酶标板结构特殊，易发生边缘效应。经研究证明抗原抗体结合、酶促反应对于温度均具有较高敏感性。酶际板周围以内部孔升温、降温度速率方面存在差异[7]，进而导致周边与内部孔显示结果不同。酶联免疫吸附试验最佳条件为水浴，温浴时间应准确按照定力要求，严格控制温箱温度，尽量保持温育过程，避免发生边缘效应[8]。

③洗板。洗涤在酶联免疫吸附试验中具有重要作用，手洗条件较差，加大误差出现率，半自动或者全自动洗板机，当未规范操作时，也会出现结果误差。残留纤维蛋白丝、洗涤液中析出结晶体均可能不同程度堵塞洗板机针小孔，未能完全洗脱，出现“花板”，造成检测结果假阳性或者假阴性[9]。因此，应注重矫正洗板机洗板时注射量以及残液量，在结束后使用蒸馏水进行清洗。将蒸馏水注满每个反应孔，确保残液量小于2 μL，拍干。为了进一步提高洗涤效果，在实验过程中，可以将机器洗涤与人工洗涤相结合，首先进行机洗，再进行1～2次人工洗板，也可以根据实际情况合理增加洗地板数量。

3.4  显色

在终止显色中应严格规范操作程序，在显色终止15分钟内读取酶标仪显示数据，注意禁止将酶标仪放置于阳光或者强光照射下，在进行预热15～30 min后再开始进行操作。显色浅情况下，肉眼难以观察，影响检测结果准确性。

3.5  质控

每批测试结果可以通过试剂盒阴阳性对照，室内质控品质控，同时做好质控图，以便于判断检测结果是否准确可靠，对于异常结果应重复实验或换厂家试剂盒对样品进行复查，并及时与临床主治医师沟通交流。

综上所述，HIV抗体酶联免疫试验操作简单，但影响结果因素具有多样化，导致结果出现假阴性或者假阳性。因此，在实验过程中要求加强质量管控工作，要求检验人员严格遵守试剂盒说明书和检测技术规范，尽可能避免或者减少影响因素的发生，提高检测结果准确性，为艾滋病的防控工作提供快速准确的科学依据。

[参考文献]

[1]  李金明.临床酶免检测技术[M].北京：人民军医出版社，2006：11.

[2]  崔海燕，薛秀娟，刘春华，等.HIV抗体确证试验不确定结果的解析[J].中国艾滋病性病，2017，12（7）：596-598.

[3]  徐俊，郭楠，刘敏.酶联免疫法筛查HIV抗体在艾滋病诊断中的应用价值[J].国际病毒学杂志，2016，23（1）：53-56.

[4]  杨芬兰，穆廷杰，陈涛.抗-HIV抗体筛查与免疫印迹试验两种检测方法的对比研究[J].国际检验医学杂志，2017，38（7）：948-950.

[5]  许卫萍.探讨乙肝五项酶联免疫吸附法检测结果常见影响因素分析[J].中外健康文摘，2014，5（2）：155-156.

[6]  查文云.酶聯免疫吸附试验中常见影响因素及控制方法[J].世界最新医学信息文摘，2015，14（29）：115.

[7]  张春艳.酶联免疫吸附试验检测结果的影响因素和应对措施[J].中国医药指南，2014，8（29）：393-394.

[8]  何莉，孙海，胡松，等.双抗夹心法酶联免疫吸附试验影响因素探析[J].检验医学与临床，2016，13（7）：873-875.

[9]  杨琪.对酶联免疫吸附试验结果OD值影响的因素分析[J].医学美学美容旬刊，2015，24（6）：221.