扣带回前部NMDA受体与睡眠剥夺模型大鼠外周疼痛感受阈值的相关性研究

杨 宇刘 畅杨 雪高久壹张翠侠苏道元

1.沈阳医学院生理学教研室，辽宁沈阳 110034；2.沈阳医学院临床医学系2012级学生，辽宁沈阳 110034

睡眠剥夺是指由于各种原因引起的睡眠缺乏导致机体疲劳及精神萎靡的症状。近年随着人们生活节奏改变及工作压力的增大，使得大部分人长期处于疲劳及睡眠缺乏状态，导致近期睡眠剥夺患者的比例不断增加[1]。研究发现，长期处于睡眠剥夺状态的人们其容易出现多系统、多脏器损伤，导致机体出现各种疾病[2]。近年已有关于睡眠剥夺对神经中枢精神行为、认知能力相关影响的研究，但关于睡眠剥夺对机体疼痛感功能的影响的作用机制目前尚报道甚少[3]。研究认为[4]，中枢皮质扣带回前部是痛觉调控及感受的关键部位，NMDA是神经信号传递过程中的重要物质。因此，本研究于2013年1月—2013年12月将通过建立睡眠剥夺大鼠模型，刺激并检测大鼠足部痛阈，从而探讨睡眠剥夺对机体痛觉神经的影响，为临床防治疲劳应激引起的机体疼痛症状提供相关理论依据。

1 材料及方法

1.1 动物及分组

选取80只Wistar成年健康雄性大鼠 （由沈阳医学院实验动物中心提供），体重为（250±20）g，昼夜节律适应性饲养 1周，室温控制在 （25±1）℃。随机将大鼠分为正常组、睡眠剥夺24h组（A组）、睡眠剥夺48h组（B组）及睡眠剥夺72h组（C组），每组各20只Wistar大鼠。

1.2 大鼠睡眠剥夺模型的建立

采用小平台水环境法制作大鼠模型，按照相关文献制作30cm×30cm×30cm的箱子，往箱子中缓慢灌注水，水温为20℃，水面与平台距离为20cm,在平台上放置食物及饮用水以供大鼠饮食。当大鼠睡眠时会由于肌肉紧张收缩而落入水中，同时在箱子中放置40W日光灯持续照射。实验前先将大鼠放入箱子中圈养1周，让大鼠适应新环境，防止环境应激性对大鼠产生影响。其中A组大鼠干预24h，B组大鼠干预48h，C组大鼠干预72h。对照组大鼠放在同样体积的箱子中圈养，但箱子中不灌注水。

1.3 热刺激大鼠足部实验

采用由成都泰盟科技有限公司提供的型号为PL-200热敏测试仪刺激大鼠足部，将大鼠放在透明的塑料笼中适应30min，待其安静后采用热敏测试仪照射大鼠足部，并记录每组大鼠足部收缩反应时间，即热刺激缩足潜伏时间。刺激时间为20s，每只大鼠测试时间间隔为45min，每只大鼠共测定3次取平均值。

1.4 Western bloting检测

实验组大鼠睡眠剥夺后，采用300mg/kg水合氯醛（厂家：郑州优然食品化工有限公司，产品规格：25kg）将大鼠麻醉断头处死，将大鼠皮质扣带回前部取出，并将其置于匀浆器中搅拌，每份组织中加入200μL细胞裂解液（厂家：南京森贝伽生物科技有限公司，型号规格：100mL,500mL），并将匀浆搅拌放入EP管中静置30min，并在4℃环境中以1200r/min的速度离心处理 15min，留取上清液。采用由美国Pierce公司提供BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取40ug总蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜及封闭实验，并加入由博士德公司提供的NR2A及NR2B抗体进行孵育震荡过夜。次日将膜取出经TBS漂洗后加入美国Gell signaling公司提供的羊抗兔二抗于室温下孵育1h，采用ECL发光法进行漂洗染色。同时采用Image 136b软件测定蛋白条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.5 统计学分析

应用SPSS 17.0软件对结果进行分析，计量资料采用均数标准差（±s）表示，组间均值的比较采用t检验，进一步的两两比较采用LWISTAR﹣t法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

A组大鼠热刺激足潜伏期为 （7.92±4.39）s与对照组 （8.02±3.12）s相比无统计学差异（P＞0.05)，而B组、C组大鼠热刺激足潜伏期分别为（6.58±1.05）s和（5.12±0.96）s，B、C 组热刺激足潜伏期显著短于对照组及A组，差异有统计学意义（P＜0.05)。B组、C组大鼠脑组织中NR2A、NR2B表达水平显著高于对照组及A组 ，差异有统计学意义（P＜0.05)，见表1。

表1 4组大鼠热刺激足潜伏期及NR2A、NR2B表达水平分析（±s）

表1 4组大鼠热刺激足潜伏期及NR2A、NR2B表达水平分析（±s）

注：A 组与对照组相比，aP ＞0.05；B组与 A组及对照组相比，bP＜0.05；C组与A组及对照组相比，cP＜0.05。

组别只数热刺激足潜伏期（s）NR2A NR2B对照组A组B组C组F值P值20 20 20 20 8.02±3.12 7.92±4.39a 6.58±1.05b 5.12±0.96c 5.223 0.000 0.42±0.11 0.44±0.13a 0.62±0.18b 0.68±0.21c 4.963 0.002 0.52±0.14 0.53±0.15a 0.78±0.12b 0.81±0.14c 5.221 0.000

3 讨论

马双双等[5]发现，睡眠剥夺后可影响机体从而增加机体应激性反应，马国亮等[6]研究发现，睡眠剥夺可导致躯体温度痛觉阈值下降，从而影响感觉阈值。郭张华[7]等研究发现，睡眠可导致大鼠足部热痛阈值下降，从而影响大鼠痛觉神经反应[5]。本研究通过建立大鼠睡眠剥夺模型从而观察睡眠剥夺对大鼠机体的疼痛症状的影响，通过研究可知，睡眠剥夺24h组大鼠热刺激足潜伏期为（7.92±4.39）s与对照组（8.02±3.12）s 相比无统计学差异（P＞0.05)，而睡眠剥夺48h组、睡眠剥夺72h组大鼠热刺激足潜伏期分别为（6.58±1.05）s和（5.12±0.96）s，B、C 组热刺激足潜伏期显著短于对照组及A组，差异有统计学意义（P＜0.05)，从而表明机体外周疼痛感受可能与内脏痛觉感受调控上行传导及下行抑制有关。

睡眠剥夺可影响神经细胞功能，从而影响神经系统可塑性及兴奋性，导致神经系统认知功能受损。孔微微等[8]发现，中枢神经区域时痛觉调控及感受的主要区域之一，通过神经可塑性及兴奋性可导致机体出现疼痛反应。相关研究认为[9]，神经系统痛觉兴奋性的增加与NMDA表达水平上调有关。NR2A及NR2B是NMDA中的重要受体，其在神经痛觉传导及感受中起到重要的作用。本研究中睡眠剥夺48h组、睡眠剥夺72h组大鼠脑组织中NR2A、NR2B表达水平显著高于对照组及睡眠剥夺24h组 ，差异有统计学意义（P＜0.05)，从而表明MR2A及MR2B参与睡眠剥夺所致的外周痛觉神经传导过程，具体作用机制还有待进一步研究。

[1]魏磊,高峻,吴文彬.前扣带回NMDA受体NR2A亚单位与睡眠剥夺模型大鼠外周疼痛感受阈值的关系 [J].解放军医学杂志,2010,35(10):1235-1237.

[2]范新六,李峰,宋月晗.四慧合剂对疲劳模型大鼠学习记忆及海马NMDA受体亚基NR2A、NR2B及EphB2受体表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2011,31(4):512-516.

[3]吴敏范，姚阳，李玉芳.猫双侧扣带回前部内脏伤害感受神经元自发电活动特性的差异[J].生理学报，2010,62(5)：450-454.

[4]范新六,李峰,宋月晗，等.加味四逆散对睡眠剥夺大鼠PFC和海马CA3区NMDA受体表达的调节作用[J].世界中医药,2012,07(3):261-262.

[5]马双双,齐阳,王莹,等.连续睡眠剥夺对大鼠认知能力、神经递质及海马结构的影响[J].海军医学杂志,2013,34(2):82-85.

[6]马国亮,杨雪,董文芳，等.WSLP运载siRNA抑制炎性疼痛大鼠脊髓背角NMDA受体1基因表达的可行性 [J].实用医学杂志,2013,29(18):2971-2973

[7]郭张华,陈建平.NMDA受体在神经病理性疼痛中作用的研究进展[J].中国疼痛医学杂志,2013,19(3):173-176.

[8]孔微微,胡三觉,罗层，等.外周NMDA受体在慢性痛中的作用及机制研究[J].神经解剖学杂志,2011,27(3):340-343.

[9]陈肖龙.两种脊髓损伤模型中NMDA受体NR2B亚基拮抗剂抑制神经病理痛[J].中国疼痛医学杂志,2012,18(7):440.