手工密闭式制备冰冻解冻去甘油红细胞方法研究

王万仲

(红河州中心血站 云南蒙自 661100)

血液的深低温保存已经取得了较好的临床应用效果,甘油作为细胞内低温保护剂,保证了红细胞在深低温环境下不易溶血。红河州中心血站自2009年开展了红细胞的冷冻保存工作,最初在无菌室开放式操作,存在细菌污染血液的风险。红细胞甘油化时采用来回式振荡器混合摇匀,解冻洗涤时用羟乙基淀粉洗涤法[1]洗涤,但上述方法耗时间、耗人力、溶血率高,效果不理想,难以满足临床紧急用血的需要。据此,笔者参考美国ACP215全自动细胞洗涤机的方法[2],使用无菌接合机无菌接驳在密闭环境下手工制备冰冻红细胞及解冻复苏洗涤,取得了满意的效果,最终制品的质量检测结果符合中华人民共和国全血及成分血质量标准[3]。

1 材料与设备

1.1 材料

复方甘油溶液,规格160mL,Rh(-)悬浮红细胞,一次性200mL转移袋,分浆夹,一次性输血器,一次性使用单采血细胞分离器800mL转移袋,9%Nacl溶液,规格80mL,三联袋0.9%Nacl溶液,规格750mL。

1.2 设备

水平旋转式细胞混合摇床,恒温循环水溶箱,无菌接合机,-70℃以下专用低温冰箱,大型低温离心机。

2 操作方法

2.1 红细胞甘油化

2.1.1 分上清 悬浮红细胞用无菌接合机接驳一个200mL一次性转移袋,称量平衡置于CR7离心机中,3000rpm离心10min,在分夹中分离出上清液,得压积红细胞,用塑料止流夹夹住连通管路,摇匀得压积红细胞。

2.1.2 加注甘油 按照悬浮红细胞标识量1、1.5、2u分别加入复方甘油溶液160、240、320mL。具体操作方法:将复方甘油溶液袋的游离管路和输血器入口端的管路无菌接合、悬浮红细胞袋的游离管路和输血器出口端管路无菌接合,通过输血器滴速控制滚轮控制甘油滴速向血袋内缓慢注入复方甘油溶液,血袋放置在水平旋转式细胞混合摇床上混匀,加注前5min滴速不超过3mL/min,5min后滴速增加到4～6mL/min,加注完毕室温下水平静置30min以上。

2.1.3 分离多余的甘油 甘油化的红细胞称量平衡,2000rpm离心5min,分浆夹中分离出未进入红细胞内多余的甘油转移入200mL转移袋内,热合、断袋。

2.1.4 倒袋 将甘油化红细胞袋游离管路和一次性使用单采血细胞分离器800mL转移袋游离管路无菌接驳,红细胞倒入800mL转移袋内,热合、断袋,电脑登记入库打印血袋流水号标签粘贴。

表1 冰冻解冻去甘油红细胞质量检测结果(n=31,s)

表1 冰冻解冻去甘油红细胞质量检测结果(n=31,s)

红细胞回收率(%)31 81.66±2.33 ≥80上清液甘油含量(g/L)31 1.93±0.49 ≤10残余白细胞(%)31 0.85±1.21 ≤1残余血小板(%)31 0.63±0.24 ≤1上清液游离血红蛋白含量(g/L)31 0.32±0.18 ≤1体外溶血率(%)31 16.33±4.48 ≤50

2.1.5 冰冻保存 甘油化红细胞放入特制防护纸盒内,立即放入-50℃速冻机进行速冻,速冻完毕立即放入-65℃以下深低温冰箱保存,得冰冻红细胞。

2.2 冰冻解冻去甘油红细胞制备

2.2.1 复苏解冻 从冰箱中取出冰冻红细胞去除外包装盒,直接放入39℃循环水溶箱中解冻,溶解时双手水平匀速摇动血袋,溶解完毕,室温水平静置5min,留取一根试管血作为质量检测标本。

2.2.2 第1次洗涤 血袋游离管路和9%NaCl溶液游离管路无菌接驳,向血袋内注入9%NaCl溶液,1、1.5、2u分别注入80、140、160mL,滴速为80ml/min,血袋置于水平旋转式细胞混合摇床上边注边摇匀,注完后热合、断袋,水平静置5min。无菌接驳一套三联袋0.9%Nacl溶液,以80mL/min注入0.9%的NaCl350mL,边注边摇匀,注完后水平静置5min,以3000rpm离心10min,分浆夹中去上清液。

2.2.3 第2次洗涤 以80mL/min向血袋内注入0.9%NaCl400mL,边注边摇匀,注完后水平静置5min,以3000rpm离心,分浆夹中去上清液,热合、断袋。

2.2.4 第3次洗涤 无菌接驳一套三联袋0.9%Nacl溶液,以80mL/min向血袋内注入0.9%NaCl150mL,边注边摇匀,以3000rpm离心10min,分浆夹中去上清液。

2.2.5 第4次或4次以上洗涤 按照2.2.4方法操作,直至离心后上清液清亮为止。

2.2.6 冰冻解冻去甘油红细胞制品 洗涤后的红细胞加入0.9%NaCl溶液悬浮,1、1.5、2u最终容量分别为(200±20)、(300±30)、(400±40)mL,摇匀,留取一根试管血作为质量检测标本,使用擀血钳将红细胞逆流至血袋塑料管内,热合5cm长两段血作配血标本,电脑登记入库打印血袋标签粘贴,得解冻去甘油红细胞制品,包装好供应临床。

2.3 数据检测

采用细胞计数仪检测红细胞回收率、残余白细胞、残余血小板,Trinder法检测上清液游离血红蛋白含量及体外溶血率,过碘酸钠法检测上清液甘油含量。

3 结果

共制备解冻去甘油红细胞31袋计51u,其质量检测结果见表1。所有血液全部供应临床,共计30多人次输血,经输血后观察无不良反应发生,无血红蛋白尿、肾功能受损等,取得良好的临床效果(表1)。

4 讨论

红细胞在甘油化及解冻去甘油的过程是影响红细胞溶血最为关键的因素,如何在制备过程中保证血液质量,同时简化操作流程是广大血液工作者追求的目标。红细胞甘油化时,笔者使用的是利用输血器严格控制甘油滴速,加注时采取先慢后快的原则,缩小细胞内外渗透压平衡时间,再使用水平旋转式细胞混合摇床代替来回式振荡器混匀血袋,保证甘油进入血袋内迅速扩散,大大降低了甘油进入血袋内由于高渗透压导致的细胞膜破裂溶血;在解冻洗涤去甘油时,笔者采用两种梯度的盐水洗涤、平衡静置等使红细胞缓慢从高渗到等渗状态的转变,有效降低了渗透压梯度的急剧变化引起的红细胞溶血;此外,整个洗涤过程中笔者均使用无菌接合机接驳各种溶液袋子之间的连通,保证血液在全封闭环境下制备,防止了在无菌室开放式制备细菌污染的机会,整个制备过程只需由一位工作人员操作。终产品经质量检测结果证实各项检测指标均符合国家标准,尤其适合中小型血站、偏远地区血站的开展,值得大力推广应用。

[1]徐国泰,吕秋霜,王春荣,等.羟乙基淀粉溶液洗涤法—快速洗涤冷冻红细胞[J].中国输血杂志,1988,1(4):191.

[2]金志坚,王拥军,徐芳,等.细胞洗涤机去甘油化技术的应用[J].中国输血杂志,2006,19(1):55.

[3]中化人民共和国.国家标准GB18469-2001.全血及成分血质量要求[S].北京:中国医疗出版社,2002:7～8.