牛奶中残留土霉素的高通量生物检测法研究

江悦娟 张德勇（浙江树人大学生物与环境工程学院 浙江杭州 310015）

引言

食品中抗生素残留问题在我国较为严重，例如国家质检总局曾有调查显示,其检测的八百份乳品样品中抗生素残留超标居不合格项目第一位。食品中残留的抗生素可经食物链进入人体并长期蓄积，这些抗生素很多对人体有毒副作用。更严重的是由于抗生素滥用会促进耐药菌产生，使人类将来或遭遇一些重大疾病“无药可医”的绝境[1]。当前抗生素的检测方法却很不健全。例如农业部《无公害农产品管理办法》明确了60余种兽药残留限值，但公布的标准检测方法却仅有不到10种[2]。当前抗生素残留的检测方法如液相、气相色谱法、免疫学检测技术等，多具有精确、灵敏等优势，但普遍存在仪器昂贵、需要专业人员、操作繁琐、耗时长等缺点。因此开发一种操作简单、廉价、高效的检测技术具有现实意义。本研究拟通过测定微孔板上培养的敏感菌在培养过程中受抑制情况来计算抗生素的含量[3-6]。其适用领域与抑菌圈法相似，但具有高通量的优势。

1 材料与方法

1.1 材料

藤黄微球菌[CMCC(B)28001]购自中国微生物菌种保藏中心。土霉素标准品购自中国兽医药品监察所。培养基、常规试剂、酶标仪等设备均由所在实验室提供。

1.2 微生物的微孔板培养条件的建立

对藤黄微球菌进行吸光度全波长扫描，确定适用波长。并设计单因素法分别对微孔板培养法的菌液初始浓度（A450在0.1-0.7范围）、培养时间（2h-5h范围）、摇床速度（150-300rpm范围）等条件进行优化，以对照孔与样品孔的差值为优化依据。

1.3 抗生素浓度与菌液受抑制程度之间的线性关系建立

将倍比稀释的抗生素(20μL/孔)加入含菌液（80μL/孔）的微孔板中，培养数小时后，测A450值。分析建立A450值增长受抑制程度与抗生素剂量之间的关系式，作为测定公式。

1.4 牛奶样品前处理方法

取10 mL牛奶样品,加10mL乙酸乙酯,超声震荡30 min,4000rpm离心10 min,乙酸乙酯层60℃旋转蒸发,残留物用2 mL甲醇溶解，待测。

1.5 检出限测定

设计阴性对照孔与空白孔，按照前面建立的方法培养3h后测定A450值，计算增加值ΔA450。其中空白孔视为样品孔进行测定和计算，得出对应的抗生素浓度值（μg/mL）。重复测定7次，并计算标准差值（SD）。检出限（μg/mL）=SD×3。

1.6 准确度与精密度测定

人为制备含有已知含量抗生素的样品，按照所建立的方法进行抗生素的前处理和含量分析。通过计算回收率反映本方法的准确度。回收率=测定浓度/理论浓度。用相对标准误差（RSD）反映方法的精密度。RSD=标准误差/算术平均值。

2 结果与讨论

2.1 微生物的微孔板培养条件的建立

藤黄微球菌在可见光范围没有特征吸收峰，其吸光度与波长成反比，在紫外光区虽有一个峰，但稳定性欠佳。综合考虑常规酶标仪的条件，本研究选择450nm作为测定波长。菌液起始浓度，确定A450值在0.33左右为宜。摇床转速以250rpm为宜。测定时间的选择，以3h最佳，时间延长虽然差值更明显，但X、Y两个因素之间的线性规律出现紊乱，符合线性规律的范围变窄。两种微孔板的比较显示96孔板好于48孔板。

2.2 抗生素浓度与菌悬液吸光度值抑制效应的线性方程建立

微孔板中的抗生素浓度与吸光度值之间是近似幂曲线。如果设定X=阴性对照孔ΔA450-样品孔ΔA450；Y=土霉素的稀释指数值；则X、Y之间存在线性关系，R2值分别为0.9837。经转换后，微孔板中抗生素浓度计算公式如下：土霉素浓度（μg/mL）=0.15625*2^[33.795(ΔA0-ΔA)-1.9486]；其中 ΔA0为阴性对照孔的A450增加值，ΔA为待测孔的A450增加值。

2.3 检出限、准确度与精密度

经计算，本方法的检出限分别为0.0591ng/mL（以微孔板中的土霉素浓度表示）。本方法平均回收率为86.33%，RSD为6.37%。

结语

为了探索一种简便高效的检测土霉素残留的生物法，以藤黄微球菌为指示菌，在96孔板上优化了其培养条件，新鲜菌液（A450约0.3）培养3h后，其A450值增长受抑制情况与抗生素的剂量之间存在相关性良好的回归方程（R2=0.9837），故可根据生长受抑制程度计算抗生素含量。