类环境激素镉对隆线溞的急性生物毒性效应

李素贞,王 鹏

0 引言

“环境激素”(Environmental Hormone)是指在人类的生产和生活过程中产生,释放到环境中并在环境中持久存在的一类化学物质,通过直接或间接的方式在动物和人类体内蓄积、富集,在机体内与激素受体结合,具有类似于人和动物内分泌激素的作用,引起人类等多种生物的神经系统失调、内分泌紊乱、免疫能力下降和生殖失常,也称为“环境荷尔蒙”。由于环境激素是由外部环境进入机体,并产生类似内激素的作用,干扰机体内分泌系统,影响生物的生存和繁衍,又称“外因性的分泌干扰物质”(Endocrine Disrupter或 Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs)[1-5]。已知和怀疑是环境激素的主要是人工合成的化学物质。目前,全球已经合成的化学物质约 1 000万种,每年新合成约10万种化学物质[6]。其中,列入环境荷尔蒙的物质有 70种左右,除镉、铅、汞等几种重金属外,其他 60余种都是有机物质。镉 (Cd)位于元素周期表第 5周期、第ⅡB族,价电子构型 4d105s2,在自然界中多以硫镉矿存在并常与锌、铅、铜、锰等矿共存。石油燃烧和垃圾废弃物的焚烧能造成镉对大气的污染,最终通过沉降污染水体和土壤;工矿排放的废水是镉污染水体的主要污染源。在一般人群中吸烟是重要的镉污染源,据估计,每天吸 20支烟的人从烟草中吸入的镉为 14～16μg[7]。对于动物和大多数不吸烟者来说,食物是镉的主要来源。中国居民喜欢和常吃的猪肝、猪肾中镉含量较高。中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国家畜肾中镉污染水平监测研究发现 2003～2006年猪肾中镉的含量大大超过了国家限量标准,检出率为 96.85%,超标率为 30.96%[8]。

近年来,有专家学者就环境激素对生物的急性毒性做了研究,但是利用生殖周期短、繁殖速度快的隆线溞评价污染物的毒性以及对环境的影响,至今很少见报道。本文主要通过镉对隆线溞的急性生物毒性(半致死浓度LC50)来讨论镉的环境激素效应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

(1)本试验采用的隆线溞 (daphnia carinata)为贵州大学资源与环境工程学院环境工程实验室提供,采集于重庆三峡库区的自然水体,经多代孤雌生殖、纯化的单克隆纯生物株Dc42。

(2)氯化镉 (CdCl2·2.5H2O)分析纯,用万分之一电子天平准确称量,去离子水配制成有效离子(Cd2+)浓度为 1 000 mg/L的储备母液,于 4℃下保存备用。

1.2 试验方法

参照中华人民共和国国家标准 GB/T 13266—91《水质 物质对蚤类 (大型蚤)急性毒性测定方法》[9]及《水和废水监测分析方法》[10],采用静态毒理试验。

(1)取 1 000 mg/L的氯化镉母液,用标准稀释水稀释成浓度为 5、2、1、0.5、0.2、0.1、0 mg/L的溶液。

(2)取各浓度溶液于食用药板上,在每个不同浓度的溶液中各加入 2只健康的隆线溞,观察 24 h死亡个数,从而找出最低全致死浓度和最大耐受浓度的范围。

(3)根据找出的最低全致死浓度和最大耐受浓度,确定正式试验溶液的浓度区间,然后按等对数间距设置 0.032、0.056、0.10、0.18、0.32、0.56、1.0、 1.8 mg/L 8个浓度组和 1个对照组 (人工稀释水)。每个浓度组各做 5个平行、重复 2个批次,试验持续时间 96 h。试验期间除不喂食外,其他条件与常规培养相同。

(4)试验开始后,前 8 h作连续观察,然后在24、48、72、96 h时对试验溞的存活情况进行记录。隆线溞的死亡以“沉入水底,轻转容器无任何反应”为死亡判断标准[11,12],试验过程中及时剔除死亡个体。

2 结果与分析

2.1 数据分析方法

死亡是被污染生物中毒的极端效应 (现象),死亡率通常被作为一个重要的生态毒理学指标用以评价污染物毒性的大小,以 LC50来确定污染物的致死剂量。本文用死亡率和LC50来综合评价镉对隆线溞急性生物毒性的大小。根据不同浓度的 Cd2+溶液中隆线溞的死亡总数及死亡时间 (表1),得到暴露在不同浓度的 Cd2+溶液的隆线溞的死亡率及死亡率趋势(图1);利用概率值法[11],求得 24、48、72、96 h的 LC50值;应用最大似然的逼近方法[11],对毒物浓度和受试隆线溞组群反应比例之间的关系,建立经验模型并对其参数进行拟合,得到相应的毒力回归方程(表2)。

表1 Cd2+溶液中隆线溞的死亡个数统计

2.2 数据分析

图1 不同浓度的 Cd2+溶液中 24、48、72、96 h降线溞的死亡率

由表1可以看出,同一时间段内随着 Cd2+浓度的增加隆线溞的死亡数量增多,即隆线溞死亡率随着Cd2+浓度的增大而升高,说明 Cd2+浓度越高毒性越强。

由图1可知,在 24、48 h两个时间段内,Cd2+浓度为 0～0.56 mg/L时,隆线溞的死亡率较小且死亡曲线重合;Cd2+浓度 >0.56 mg/L时死亡率急剧增大,Cd2+浓度增大至 1.8 mg/L时隆线溞死亡率达到100%(全部死亡);72 h时,Cd2+浓度 >0.32 mg/L时死亡率急剧增大,Cd2+浓度增大至 1.0 mg/L时隆线溞死亡率达到 100%;96 h时,当 Cd2+浓度 > 0.032 mg/L时隆线溞的死亡率逐渐增大,当 Cd2+浓度增大至 1.0 mg/L时隆线溞死亡率达到 100%。

表2 不同暴露时间Cd2+对隆线溞的半致死、致死浓度 mg/L

4条死亡率变化曲线说明了,随着时间的延长隆线溞的死亡在不断增加,可能是由于随着隆线溞在含 Cd2+溶液暴露时间的延长,Cd2+在隆线溞体内逐渐积累,最终超过隆线溞个体耐受限度而致其死亡。当 Cd2+浓度为 0.056 mg/L时,4条死亡率变化的曲线均出现拐点,可能是同一物种的不同个体对环境有毒有害因素的反应不同,或同一个体在不同的生长发育期对环境污染的敏感性不同,从而造成个别隆线溞对暴露反应的差异性[13],而在本试验中,溶液中 Cd2+浓度为 0.056 mg/L的 5个平行样品中共 50只隆线溞,只有 1个死亡,由此导致的死亡率变化曲线出现拐点在误差允许范围之内。

由表2可知在试验条件下,Cd2+对隆线溞的半致死浓度随暴露时间的增加而迅速降低,24 h-LC50为 1.010 8 mg/L、48 h-LC50为0.794 6 mg/L,72 h-LC50为 0.499 3 mg/L,96 h-LC50为 0.200 3 mg/L,95%置信区间 0.169 4～0.233 7,安全浓度为 0.002 0 mg/L。此结果与杨静(2006)研究中的 Cd2+对隆线溞LC50有一定的差异[14],这种差异与隆线溞生长状况、生物毒性试验的环境条件及试验方法有关,致使试验中隆线溞对同一毒物的敏感性也存在差异。

应用最大似然的逼近方法对毒物浓度和隆线溞组群反应比例之间的关系建立经验模型并对其参数进行拟合,对所得各时间段的毒力回归方程进行卡方检验,表明所求毒力回归曲线用来描述镉对隆线溞的毒性作用是合适的。对隆线溞的急性生物毒性试验表明 Cd2+有较强的生物毒性,对水生生物有很大的毒害作用。

为了考察试验中同浓度的 5个平行两两之间差异的显著性,采用Duncan’s新复极差法进行多重比较,应用单因素试验统计分析 (表3、4)来推断真实的处理效应是否存在。表中的 p值是传统所说的α水平(显著水平),通过 p值精确地反映 Cd2+对隆线溞急性毒性的结果的显著水平。如果 0.01≤p< 0.05则结果显著;如果 0.001≤p<0.01,则结果极显著;p<0.001,则结果很高地显著;p>0.05,则结果被认为没有统计显著性。

表3 Cd2+对隆线溞急性毒性试验24、48 h单因素统计分析 mg/L

由表3知 Cd2+对隆线溞急性毒性试验中 p值均为 0.000 1(p<0.001),都表现出很高的显著水平。试验进行 24 h时不同浓度 Cd2+对隆线溞急性毒性显著的水平排序依次为:1.8>1.0>0.56= 0.32=0.18=0.10=0.056=0.032=0,即 Cd2+的浓度在 0～0.56mg/L范围内处于同一显著水平。48 h的急性毒性试验结果显著水平跟 24 h的相同。

表4 Cd2+对隆线溞急性毒性试验72、96 h单因素统计分析 mg/L

由表4知 Cd2+对隆线溞急性毒性试验中 p值均为 0.000 1(p<0.001),都表现出很高的显著水平。由表4知试验进行至 72 h时不同浓度 Cd2+对隆线溞急性毒性显著的水平依次为:1.8=1.0> 0.56>0.32=0.18=0.10=0.056=0.032=0,Cd2+的浓度为 1.0 mg/L时呈现出的显著性与 1.8 mg/L相同。96 h时不同浓度 Cd2+对隆线溞急性毒性显著的水平排序依次为:1.8=1.0=0.56>0.32> 0.18>0.10=0.056>0.032=0,Cd2+的浓度为0.56 mg/L时呈现出的显著性与 1.8 mg/L相同, 0.056 mg/L时的显著水平与 1.0 mg/L相同。由此可知 p值精确地反映 Cd2+对隆线溞急性毒性作用的显著水平随着时间的延长而更加显著,采用Duncan’s新复极差法进行多重比较更能真实地反映不同浓度的 Cd2+对隆线溞急性毒性效应的大小。

3 讨论

(1)试验结果表明,在同一时间段内,隆线溞的死亡率随着Cd2+浓度的增大而升高,说明Cd2+浓度越高,对隆线溞急性毒性作用越强。

(2)Cd2+对隆线溞的 24、48、72、96 h的半致死浓度 (LC50)分别为 1.010 8、0.794 6、0.499 3、 0.200 3 mg/L,安全浓度为 0.002 0 mg/L。即随隆线溞在 Cd2+溶液中的暴露时间的增加,半致死浓度呈下降趋势,反映隆线溞对 Cd2+毒性的耐受程度随时间的延长而降低。

据报道,镉对鲫鱼的 24、48、72、96 h的半致死浓度 (LC50)分别为 11.7、8.68、6.86、5.85 mg/L,安全浓度为 0.59 mg/L;镉对罗非鱼的 24、48、72、96 h的半致死浓度 (LC50)分别为 27.733 9、16.861 1、 12.425 3、9.118 1 mg/L,安全浓度为0.91 mg/L。(柏世军.水环境镉对罗非鱼的毒性作用和机理探讨[D].浙江大学.2006)因此,用隆线溞监测环境激素对生物的急性毒性更具有预见性。

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