不同蜂蜜抗氧化活性和抑制酪氨酸酶活性的比较

张敏，黄京平，赵文，王鹏，金玥，胡菡，薛晓峰，张金振

（中国农业科学院蜜蜂研究所农业农村部蜂产品质量监督检验测试中心（北京），北京 100193）

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜味物质。作为药食同源产品，蜂蜜除含有葡萄糖、果糖等营养成分外，还含有维生素、氨基酸、酚类化合物等丰富的生物活性物质，不仅具有较高的营养价值，还具有抗菌、抗氧化和调节机体免疫力等功效[1-3]。

酚酸和黄酮类化合物是蜂蜜中主要的抗氧化活性物质，其含量与蜂蜜抗氧化能力具有相关性[4,5]。目前，蜂蜜中总酚酸的测定多采用福林-酚显色法，用没食子酸或原儿茶酸做当量；总黄酮的测定采用硝酸铝或三氯化铝比色法，用槲皮素或芦丁做当量；体外抗氧化能力主要通过DPPH自由基清除、Fe3+还原、阳离子脱色、氧化自由基吸收能力等方法测定[4-8]。由于测定方法种类较多，不同文献间测定方法不统一，因此难以根据文献报道的数据系统地比较不同蜂蜜的差异。

酪氨酸酶是生成黑色素的关键限速酶，对其活性抑制的强弱是目前评价保健品和化妆品等是否具有美白功效的指标[9]。由于曲酸、熊果苷等酪氨酸酶抑制剂的安全性、稳定性、穿透力等方面较差[10]，利用天然产物的有效成分来抑制酪氨酸酶活性具有应用前景。有研究表明蜂蜜对酪氨酸酶具有抑制作用，并推断可能是蜂蜜中酚酸、黄酮类化合物在发挥作用[11]。酚酸和黄酮类化合物的羟基可与酪氨酸酶的某个部位形成氢键，还可与酪氨酸酶活性部位的铜离子相互作用，从而抑制酪氨酸酶活性[12,13]。但蜂蜜中酚酸和黄酮类化合物含量与酪氨酸酶活性抑制能力的相关性还不清楚。

本文系统比较了我国常见的 10种植物源蜂蜜的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的能力，并研究了总酚酸和总黄酮含量与这2种生物活性的相关性，为蜂蜜的营养功能开发和评价提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

10种植物源蜂蜜（椴树蜜、油菜蜜、枣花蜜、洋槐蜜、荆条蜜、荞麦蜜、龙眼蜜、荔枝蜜、黄芪蜜、树参蜜）信息见表1。所有样品均直接从蜂农处购买，保存于4 ℃条件下备用。通过花粉含量测定（除洋槐蜜花粉率为19.20%~25.70%，其余蜂蜜花粉率均大于50%）保证样品的真实性。

表1 不同品种蜂蜜总酚酸、总黄酮含量及其抗氧化活性和酪氨酸酶抑制能力Table 1 Contents of total phenolic acids and total flavonoids, and their antioxidant and tyrosinase inhibitory activities of honey from different nectar plants

原儿茶酸（PCA，纯度≥98%）、槲皮素（QUE，纯度≥98%）、酪氨酸酶（1 240 U/mg）、左旋多巴（纯度≥99%）、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（纯度≥95%）、Folin-Ciocalteu试剂（1 moL/L）均购自上海源叶生物科技有限公司；总抗氧化能力（FRAP法）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；碳酸钠、三氯化铝、磷酸氢二钠、柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、95%乙醇购自福晨化学试剂有限公司。

1.2 仪器和设备

Multiskan FC photometer全波长酶标仪，赛默飞世尔科技中国有限公司；高速离心机，曦玛离心机扬州有限公司；涡旋振荡器，上海宛胜仪器设备有限公司；水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总酚酸的测定

参考曹炜等[14]的方法，吸取0.1 g/mL的蜂蜜溶液1.00 mL至10 mL容量瓶中，加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL，混匀，再加入1 moL/L的碳酸钠溶液5 mL，用超纯水定容至刻度，混匀。室温、避光条件下反应1 h，吸取反应液200 µL至96孔板，于760 nm处测定吸光度值。蜂蜜总酚酸含量以原儿茶酸的相对量表示。

1.3.2 总黄酮的测定

参考孙丽萍等[15]的方法，称取10.0 g蜂蜜样品，加入5 mL超纯水超声至溶解。8 000 r/min离心5 min，吸取上清液3 mL于10 mL容量瓶中，加入m=1%三氯化铝溶液1 mL，φ=95%乙醇定容至刻度，摇匀，静置10 min。吸取反应液200 µL至96孔板，于405 nm处测定吸光值。蜂蜜总黄酮含量以槲皮素的相对量来表示。

1.3.3 抗氧化能力的测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力测定

参考王海敏等[16]的方法，用超纯水将样品稀释成0.01、0.05、0.20、0.50、0.80 g/mL的蜂蜜溶液，按A1：100 µL水+100 µL DPPH自由基乙醇溶液（浓度为 0.1 mmol/L）；A2：100 µL 样品+100 µL DPPH 自由基溶液；A3：100 µL样品+100 µL无水乙醇，加入到96孔板，混匀后于室温避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度。按公式（1）计算样品对 DPPH自由基的清除率（I，%）。以维生素C为阳性对照。

式中：

A1——溶剂本底吸光值；

A2——样品溶液吸光值；

A3——样品溶液空白吸光值。

1.3.3.2 铁离子还原能力的测定

按照试剂盒提供的方法测定蜂蜜铁离子还原能力。用超纯水将蜂蜜稀释至0.5 g/mL，在96孔板内依次加入5 µL样品溶液和180 µL FRAP工作液，37 ℃孵育5 min，于593 nm下测定各样品吸光值。以FeSO4-7H2O为标准品，用超纯水稀释成不同浓度的标准工作液，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。总抗氧化活性用达到相同吸光度所需FeSO4-7H2O的浓度来表示。

1.3.4 酪氨酸酶抑制实验

参考《T/SHRH 015-2018化妆品-酪氨酸酶抑制实验方法》并进行优化，用pH值6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸（PBS）缓冲液将样品稀释为 0.01、0.05、0.20、0.50、0.8 g/mL的蜂蜜溶液，按照A：1 mL样品+0.5 mL 100 u/mL酪氨酸酶溶液；B：1 mL样品+0.5 mL PBS缓冲液；C：1 mL PBS缓冲液+ 0.5 mL 100 u/mL酪氨酸酶溶液；D：1.5 mL PBS缓冲液加入10 mL离心管中，混匀，于37 ℃避光水浴孵育10 min。依次在各管中加入1.0 mg/mL的左旋多巴溶液2 mL，反应5 min，即刻在475 nm处测定吸光值。每批样品以曲酸为阳性对照，IC50在0.05 mg/mL~0.15 mg/mL，则认为试验有效。酪氨酸酶抑制率（E，%）按公式（2）计算：

式中：

A——为样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值；

B——不含酪氨酸酶样品本底吸光值；

C——未加样品时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值；

D——溶剂本底吸光值。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。所有数据均以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析（One-Way Analysis of Variance，ANOVA）和Tukey's分析组间差异显著性。采用GraphPad Prism 9.0通过浓度与清除率（抑制率）拟合曲线计算DPPH自由基清除率和酪氨酸酶抑制率IC50值。

2 结果与分析

2.1 总酚酸和总黄酮含量

蜂蜜中酚酸和黄酮类物质主要来源于蜜源植物的花蜜、花粉或蜂巢中蜂胶的迁移等，因此不同植物来源的蜂蜜样品之间总酚酸和总黄酮含量差异较大[17-19]。表1中可知 10种蜂蜜总酚酸含量为116.46~2 133.33 mg PCA/kg，总黄酮含量为8.31~120.81 mg QUE/kg。其中，荞麦蜜总酚酸和总黄酮含量显著高于其他几种蜂蜜（p＜0.05），平均含量分别为1 320.69 mg PCA/kg和81.64 mg QUE/kg；枣花蜜含量次之，总酚酸和总黄酮平均含量分别为467.31 mg PCA/kg和38.56 mg QUE/kg；洋槐蜜的含量最低，总酚酸和总黄酮平均含量分别为137.40 mg PCA/kg和10.12 mg QUE/kg；其他几种蜂蜜总酚酸含量在201.60~394.63 mg PCA/kg之间，总黄酮含量在16.69~44.01 mg QUE/kg之间。

图1 不同植物源蜂蜜总酚酸（a）和总黄酮（b）含量显著性分析Fig.1 Significant analysis of total phenolic acid (a) and total flavonoid (b) contents ofdifferentbotanical honey

Małgorzata等[6]测定的波兰荞麦蜜总酚酸平均为2 540 mg GAE/kg，总黄酮平均为140 mg QUE/kg，杨二林等[7]测定的陕西不同地区枣花蜜总酚酸平均含量为 359.16 mg GAE/kg，总黄酮平均含量为30.76 mg RT/kg，这说明酚酸和黄酮的含量除了受蜜源植物种类的影响，还与地理位置有关[20]。

2.2 抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除能力

样品对DPPH自由基的清除能力反映其抗氧化能力，IC50值越低，说明蜂蜜抗氧化能力越强。10种蜂蜜清除DPPH自由基IC50值和显著性分析结果见表1和图2a。不同植物源蜂蜜清除DPPH自由基能力具有差异性。荞麦蜜IC50值最低，平均值为29.41 mg/mL，其清除DPPH自由基能力显著高于其他蜂蜜（p＜0.05）；其次是枣花蜜，IC50平均值为 46.36 mg/mL；洋槐蜜IC50值最高，平均值为515.43 mg/mL，其清除DPPH自由基能力显著低于其他蜂蜜（p＜0.05）；其他几种蜂蜜IC50值为64.38~197.85 mg/mL。曹炜等[14]对枇杷、枸杞、黄芪、党参和荆条5种蜂蜜清除DPPH自由基能力研究同样发现不同蜂蜜清除DPPH自由基能力具有差异性。

图2 不同植物源蜂蜜DPPHIC50（a）和铁离子还原力FRAP（b）显著性分析Fig.2 Significant analysis of DPPHIC50 (a) and FRAP (b) of different botanical honey

2.2.2 铁离子还原能力（FRAP法）

在酸性条件下，抗氧化剂能够提供电子将Fe3+-TPTZ还原成蓝色Fe2+-TPTZ，亚铁离子的浓度与抗氧化剂给电子数成正比，因此可用亚铁离子浓度高低表示蜂蜜的抗氧化能力强弱。10种蜂蜜FRAP值为0.50~7.39 mmol Fe2+/kg（表1）。荞麦蜜铁离子还原能力最强（图2b），FRAP值平均为4.66 mmol Fe2+/kg，优于Beretta G等[21]测定的金合欢蜜（0.80 mmol Fe2+/kg）、板栗蜜（3.89 mmol Fe2+/kg）和菊苣蜜（2.1 mmol Fe2+/kg）；洋槐蜜最弱，平均值为0.61 mmol Fe2+/kg；其他几种蜂蜜FRAP值范围在0.87~2.79 mmol Fe2+/kg，与巴西蜂蜜铁离子还原能力（0.66~3.89 mmol Fe2+/kg）相当[22]。Monika K等[23]测定波兰蜂蜜铁离子还原能力结果显示荞麦蜜＞荆条蜜＞洋槐蜜，与本研究结果一致。

2.3 酪氨酸酶抑制能力

不同植物源蜂蜜对酪氨酸酶活性抑制能力具有差异性，其IC50值为9.16~350.26 mg/mL（表1）。荞麦蜜IC50平均值为12.19 mg/mL，对酪氨酸酶活性抑制能力显著优于其他9种蜂蜜（p＜0.05）；枣花蜜次之，IC50平均值为 49.50 mg/mL；黄芪蜜和树参蜜酪氨酸酶活性抑制能力较差，IC50范围为 285.63 mg/mL~350.26 mg/mL；其他几种蜂蜜酪氨酸酶活性抑制能力IC50为 79.22~256.74 mg/mL。Sıcak 等[24]测得的土耳其松树蜜和百里香蜂蜜正丁醇萃取物酪氨酸酶活性抑制IC50值分别为49.50 mg/mL和60.67 mg/mL，低于本实验中测定的荞麦蜜。

图3 不同植物源蜂蜜对酪氨酸酶抑制率IC50显著性分析Fig.3 Significance analysis of tyrosinase inhibition rate IC50 of different botanical honey

2.4 相关性分析

为探究蜂蜜总酚酸、总黄酮含量与抗氧化能力、酪氨酸酶活性抑制能力的相关性，对蜂蜜中总酚酸、总黄酮含量以及FRAP抗氧化活性、DPPH自由基清除活性、酪氨酸酶抑制活性之间进行 Pearson相关性分析，结果如表2所示。

2.4.1 抗氧化能力与总酚酸、总黄酮的相关性

表2相关性结果表明，蜂蜜总酚酸和总黄酮的含量与铁离子还原能力相关性极显著（p＜0.01），与清除DPPH自由基IC50相关性显著（p＜0.05）。蜂蜜总酚酸和总黄酮的含量与铁离子还原能力的相关系数高于与清除DPPH自由基的相关系数，这是因为不同抗氧化方法的反应机理不同，同一物质可能会表现出不同的抗氧化能力。油菜蜜和荆条蜜总酚酸和总黄酮含量差异显著，但DPPH自由基清除能力相当，这说明蜂蜜抗氧化能力除了受总酚酸和总黄酮含量的影响外，还可能与酚酸和黄酮的种类有关。Monika等[23]通过ABTS和FRAP两种方法比较了8种酚酸和4种黄酮类化合物的抗氧化能力，结果显示，抗氧化能力与对羟基苯甲酸、对香豆酸、咖啡酸相关性显著，与阿魏酸、苯甲酸、槲皮素相关性不强，且不同化合物与ABTS和FRAP的相关系数不同。

2.4.2 酪氨酸酶抑制能力与总酚酸、总黄酮的相关性

蜂蜜对酪氨酸酶抑制活性1/IC50值与总酚酸和总黄酮相关系数分别为0.922和0.898（表2），呈显著正相关，表明酚酸和黄酮类物质在酪氨酸酶活性抑制方面发挥作用。有文献报道酚类化合物如原儿茶酸、p-香豆酸、绿原酸、槲皮素和山奈酚等均可抑制酪氨酸酶活性[25-29]。本研究表明，总酚酸和总黄酮含量最高的荞麦蜜抑制酪氨酸酶能力最强，洋槐蜜总酚酸和总黄酮含量虽低，但显现出较高的酪氨酸酶活性抑制能力，说明酪氨酸酶抑制能力还可能与酚酸和黄酮的种类有关。Corradi I等[30]在测定植物提取物对酪氨酸酶活性抑制能力中发现，没食子酸甲酯和没食子酸表现出较强的酪氨酸酶活性抑制能力，而咖啡酸则不强。

3 结论

本研究比较了 10种不同植物源蜂蜜的总酚酸和总黄酮含量的差异，通过DPPH自由基清除和铁离子还原能力评价其抗氧化能力，通过酪氨酸酶抑制试验评价不同蜂蜜美白效果，并分析了总酚酸和总黄酮含量与这两种生物活性之间的相关性。结果表明，不同植物源蜂蜜均具有抗氧化和抑制酪氨酸酶活性。荞麦蜜表现出最强的抗氧化能力和酪氨酸酶活性抑制能力，其总酚酸和总黄酮含量也相对最高。相关性分析表明，蜂蜜中总黄酮和总酚酸在抗氧化活性和酪氨酸酶活性抑制方面发挥作用。本研究从抗氧化活性和抑制酪氨酸酶评价不同植物源蜂蜜的品质，为蜂蜜功能食品开发提供依据，为消费者选购蜂蜜提供参考。