南极磷虾过敏原的超高效液相色谱-飞行时间质谱方法检测

李紫薇，张晓梅，胡玲萍，李兆杰，张鸿伟，薛长湖

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003）（2.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛 266002）

南极磷虾（Euphausia superba），又称大磷虾或南极大磷虾[1]，属节肢动物门甲壳亚门磷虾目磷虾科，广泛分布于环南极海域，在南极生态系统中起到了十分重要的作用。南极磷虾的资源蕴藏量巨大，据估计在6.5～10亿吨之间[2]，至今渔获总量已超过600万吨[3]。有学者称，若以生物质能来算，南极磷虾可被誉为“世界上最成功的物种”[4]。因其生物量巨大，南极磷虾是人类重要的食物资源宝库，其不仅是人类目前发现的蛋白质含量最高的生物（蛋白质含量高达50%以上）[4]，含有7种人体必需氨基酸，同时还富含以EPA和DHA为代表的ω-3系不饱和脂肪酸[5]。此外，磷虾肉质细嫩鲜美，具有抗动脉粥样硬化和抗胃溃疡的药用价值[6]。十九大以来，我国致力于打造蓝色海洋强国，大力开发海洋资源，南极磷虾作为南极海域中资源量最大的生物物种，其开发利用前景十分广阔。

飞行时间质谱（Q-TOF-MS）是一种基于高效离子淌度技术的高性能质谱[16]，选择性和灵敏度很高，可以方便快速进行筛查鉴定。超高效液相色谱（UPLC）与常规高效液相色谱(HPLC)相比，有着更高的分离效率、分辨率、灵敏度和峰容量[17]，目前在代谢产物高通量筛选，痕量物质分析以及复杂生物样本分析中有着广泛应用[18～20]。超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）在复杂化合物的分析鉴定中有着巨大作用，在过敏原检测上的应用十分广泛。三重四极杆质谱有着高的灵敏度和重现性，也为过敏原蛋白的鉴定提供了重要的手段。本研究利用超高液相色谱-飞行时间质谱联用技术和三重四极杆质谱对南极磷虾中过敏原进行检测，以期为食品中过敏原的检测提供一种快速简便的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾，辽宁省大连海洋渔业集团；测序级胰蛋白酶（比活18523 U/mg），美国Promega公司；色谱级甲酸，美国Sigma公司；色谱级乙腈，美国Fisher公司；碘代乙酰胺，美国Sigma公司；Folin-酚乙液，北京索莱宝科技有限公司；二硫苏糖醇、尿素、碳酸氢铵、碳酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、五水硫酸铜、牛血清蛋白，均为分析纯国药集团化学试剂有限公司；Nexera X2 30A超高效液相色谱仪，日本岛津公司；AB SCIEX Triple TOF® 5600质谱仪，美国AB SCIEX公司；Triple QuadTM 5500三重四级杆质谱仪，美国AB SCIEX公司；MQS50001型超纯水系统，美国Millipore公司；AB135-S型精密电子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；A11分析研磨机，德国IKA公司；CR21G II高速冷冻离心机，日本CHTACHI公司；超滤离心管UFC501008，美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南极磷虾蛋白提取

用液氮将冷冻南极磷虾肌肉研磨至粉末状。称取虾粉1.00 g，加入10.00 mL蛋白提取液（8 mol/L尿素，50 mmol/L NH4HCO3），垂直震荡30 min，4 ℃，15000 r/min低温高速离心20 min，取上清，待下步测定蛋白含量。

1.2.2 Folin-酚法测定提取液蛋白含量

Folin-酚甲液由A液和B液5：1混合而成，临用时现配（A液：10.00 g碳酸氢钠，2.00 g氢氧化钠，0.25 g酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水；B液：0.25 g五水硫酸铜溶于100 mL蒸馏水水中），乙液为商品化试剂。标准曲线绘制：取6支试管，分别加入0、200、400、600、800、1000 μL mg/mL的BSA溶液，用蒸馏水补足到1.00 mL。每管加入Folin-酚甲液5.00 mL，摇匀，于25 ℃静置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.50 mL，迅速摇匀，30 ℃静置30 min，以蒸馏水为空白，在650 nm处比色测吸光值。样品蛋白含量测定如标曲配制，取样量为1.00 mL，分别为原液和梯度稀释10倍、100倍、1000倍的样品。

1.2.3 胰蛋白酶酶解蛋白提取液

将上述蛋白提取液分为三份，均各取 100 μL上清，分别加入2 µL 1 mol/L二硫基苏糖醇，60 ℃条件下反应1 h。取5.00 µL、1 mol/L碘代乙酰胺（现配），加入至已冷却至室温的上述反应液中，避光室温反应1 h。采用10 K超滤离心管在15000 r/min离心超滤20 min后，用200 µL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液洗涤膜上层蛋白，共洗涤三次。将胰蛋白酶溶液按酶底比1：50加入至上述蛋白溶液中，37 ℃酶解16 h，使酶解彻底。再用超滤离心管15000 r/min离心超滤20 min，收集下层肽段。

磁性纤维素对亚甲基蓝的吸附过程受吸附反应温度、溶液pH值和吸附时间的影响，吸附的最佳实验条件是反应温度293 K；溶液pH值为7；吸附时间120 min。磁性纤维素对亚甲基蓝的吸附动力学特征用准二级动力学模型拟合较好；等温吸附以Langmuir拟合最佳，由此可得磁性纤维素对亚甲基蓝最大理论吸附容量为123.15 mg·g-1。

1.2.4 南极磷虾中过敏原的分离和检测

采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)对南极磷虾中的过敏原分离和检测。液相色谱和质谱条件色谱柱：安捷伦AdvanceBio Peptide Map column (150 mm×2.10 mm，130 Å，2.70µm)；柱温：40 ℃。流动相A：0.10%甲酸-乙腈，流动相B：0.10%甲酸-水；流速：0.25 mL/min；进样量：30 μL；梯度洗脱时间：46.00 min；流动相梯度：0～2.00 min（95%B），2.00～17.00 min（95%～80%B），27.00～37.00 min(85%～65%B) ， 37.00～39.00 min（65%～20%B），39.00～42.00 min（20%～95%B），42.00～46.00 min（95%B）。质谱扫描范围：350～1500 u，正离子反应模式，雾化气 GS1：35 psi，辅助加热器GS2：45 psi，气帘气压35 psi，喷雾电压5500 eV，离子源温度：500 ℃，解簇电压：100 V，碰撞能量：10 eV，信号强度阈值：2e4。高效液相色谱-三重四级杆质谱（HPLC-QQQ-MS），液相色谱条件：色谱柱及流动相同 UPLC-QTOF-MS；柱温：40 ℃，流速：0.35 mL/min；进样量：20 µL；流动相梯度：0～0.50 min，5%B；0.50～17.00 min，5%～35%B；17.00～17.50 min，35%～95% B；17.50～20.00 min，95% B；20.00～20.10 min，95%～5% B；20.10～25.00 min，5% B。正离子模式，喷雾电压为5500 V，雾化气为35 psi，离子源温度为575 ℃。解簇电压和碰撞能量由Skyline软件来优化，驻留时间设为5.00 ms。

1.3 数据处理

将计算机采集的肽段质荷比、保留时间和响应强度等数据转成wiff文件，导入Protein PilotTMSoftware，选用 NCBI的南极磷虾数据库（NCBI-Euphausua superba.fasta）进行数据检索。Protein Pilot软件参数设置如下：搜库方法：Paragon method；消化：Trypsin；仪器：TripleTOF 5600；物种：None；ID Focus：Amino acid Subtitutions，Biological modifications；Search Effort：Thorough ID；检测蛋白质阈值（Unused Protscore（conf））：＞0.05%（10.00%）；提交错误发现率（False Discovery rate analysis，FDR）分析报告。

2 结果与讨论

2.1 南极磷虾提取液蛋白含量的测定2.1.1 标准曲线的建立

图1 蛋白含量标准曲线Fig.1 Standard curve of Protein content

以蛋白含量为横坐标，650 nm处吸光值为纵坐标，线性回归方程为：y=3.0286x-0.0075（R2=0.9993），绘制的标准曲线如图1所示。

2.1.2 南极磷虾提取液中蛋白含量计算

为了准确测定南极磷虾提取液的蛋白含量，必须使吸光度在线性范围内，因此采用了稀释100倍的样品（稀释一百倍的误差，是非常大的，要给出误差范围），测得650 nm处的吸光值为0.718，换算成提取液蛋白含量为24 mg/mL。

2.2 南极磷虾蛋白提取液胰蛋白酶降解产物的UPLC-Q-TOF-MS分析

图2 南极磷虾胰蛋白酶酶解产物的UPLC-Q-TOF-MS代表性总离子流色谱图Fig.2 Representative total ion current (TIC) chromatogram of UPLC-Q-TOF-MS of trpsin digested peptides of Antarctic krill

按上述 1.2.4项下色谱及质谱条件所得的南极磷虾胰蛋白酶酶解产物的有代表性的总离子流色谱图见图2。

由图2可见，使用UPLC-QTOF对南极磷虾蛋白提取液胰蛋白酶酶解产物进行分析检测，其得到的谱图峰型对称，谱峰尖锐，数据采集状况良好，谱图重现性好。

2.3 南极磷虾过敏原及主要肽段的鉴定

南极磷虾胰蛋白酶降解产物经UPLC-Q-TOF-MS检测的数据在ProteinPilot软件中用NCBI南极磷虾蛋白数据库进行搜库。

在95%的置信度下，南极磷虾酶解产物中共鉴定到222条多肽，对应的蛋白种类为28种，表1列举了鉴定得到的代表性蛋白信息和相应肽段数目。其中原肌球蛋白和精氨酸激酶为南极磷虾中两种常见的过敏原，对应的肽段条数分别为74和44。表2列出了南极磷虾中两种主要过敏原对应的响应强度最高的6条肽段。

表1 南极磷虾中鉴定的主要蛋白及肽段数目Table 1 Primary protein and peptide amount of Antarctic krill

表2 南极磷虾中的过敏原及代表性肽段Table 2 Allergens of Antarctic krilland representative peptides

2.4 南极磷虾主要过敏原代表性肽段的三重四级杆验证

为进一步准确验证过敏原肽段，提高结果重现性和稳定性，本实验利用三重四极杆多反应监测（MRM）模式对代表性肽段进行验证。使用生物信息学软件Skyline对每个过敏原响应强度最高的6个肽段进行模拟酶解，产生传输离子对，对其进行检测鉴定肽段并表征过敏原蛋白。

图3 肽段LQTLENDLDQVSEALLK的提取离子色谱图Fig.3 Representative extracted ion chromatogram (XIC) scan spectra of peptide LQTLENDLDQVSEALLK

图4 肽段LQTLENDLDQVSEALLK的二级质谱图Fig.4 Secondary ion mass spectrometry (SIMS) of peptide LQTLENDLDQVSEALLK

表3列出了南极磷虾主要过敏原代表性肽段的传输离子对及对应的碰撞能量（CE）和解簇电压（DP）值，选取两个代表性肽段作为例证。

图 3和图 4分别为南极磷虾过敏原代表性肽段LQTLENDLDQVSEALLK的提取离子色谱图和二级质谱图，母离子为 644.01，子离子分别为 1002.55、887.52、759.46、660.39、815.38，其保留时间为16.38 min。TropomyosinSEQ ID：

MDAIKKKMQAMKMEKDSAMDRSDALEAQN KETNAKADKADDEVHNLQKRLQTLENDLDQVS EALLKANTQLVEKDKALQNAEGEVAALNRRIQLL EEDLERSEERLNTATTKLAEASQAADESERMRKV LENRSMLDEERMDALESQLKEARLLAEEADRKY DEVARKLAMVEADLERAEERAEAGENKIVELEEE LRVVGNNLKSLEVSEEKANQREEAYKEQIKHLTH KLKTAEARAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVNEK EKYKGITDELDQTFNELSGY

表3 Skyline预测的南极磷虾过敏原代表性肽段解簇电压和碰撞能量Table 3 The declustering potential and collision energy values of representative peptide of Antarctic krill predicted by Skyline

图5 肽段GNINEGVPVHSVR的提取离子色谱图Fig.5 Representative extracted ion chromatogram (XIC) scan spectra of peptide GNINEGVPVHSVR

图6 肽段GNINEGVPVHSVR的二级质谱图Fig.6 Secondary ion mass spectrometry (SIMS) of peptide GNINEGVPVHSVR

图 5和图 6分别为南极磷虾过敏原代表性肽段GNINEGVPVHSVR的提取离子色谱图和二级质谱图，其母离子为 703.87，子离子分别为 1122.59、1007.56、361.22、285.16、400.18，其保留时间为7.63 min。

Arginine kinase SEQ ID：

MGYSEVELIQQMIAAINKLGVEDTVLQPKYRI ADIPPYPEIKSVDSLVAKYVSQKVWSKLAGHKTKT SGFTLSQAIACAVEFDNQHCGIYAGDWDSYKDFA DIFDPLIQEYHGLEPNAVHTTDMDASKIKGNINEG VPVHSVRIRVGRSIDGYGLSPGITKEQRLAVEEMM KNGFTKLKGDLAGNYYPLSDMDEKVRQQLVDDH FLFMSGDPNLQVAGMERDWPEGRGIFHNEAKTFL VWVNEEDQLRIISMEKGGNVKGVFERLASGIRAV GDSVWTECGKEFACDPKYGYIHSCPTNLGTGMRA SVHVDLPGWAKEGMDALKKRCEELKVQPRGTKG ESGGVTGHTFDISNKHRLGYSEVELVQCMIDGVN TLHAEDMELQKKHGAGA

3 结论

本研究利用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术对南极磷虾过敏原进行检测，鉴定出了南极磷虾体内两种主要过敏原即原肌球蛋白和精氨酸激酶，对应的肽段条数分别为74和44条，并通过Skyline生物信息学软件对其进行模拟酶切，在三重四极杆多反应监测模式下对其进行验证。这种方法快速简便，灵敏度高，重现性好。突破了传统生物检测技术操作复杂，费时冗长，成本较高的障碍，为食品安全和水产品市场提供了有利的检测技术，也为后期过敏原的消减提供了理论基础，为我国国民健康提供了有效的帮助。